[發明專利]一種生產菜油甾醇的釀酒酵母工程菌及構建方法

有效

• 申請號: 202110176165.4
• 申請日: 2021-02-06
• 公開（公告）號: CN112812983B
• 公開（公告）日: 2022-10-11
• 發明（設計）人: 饒志明;周武林;邵明龍;楊套偉;張顯;徐美娟
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/90;C12N15/53;C12N15/55;C12P33/00;C12R1/865
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 林娟

1.一種釀酒酵母工程菌，其特征在于，所述釀酒酵母工程菌敲除了C-22甾醇去飽和酶Erg5，并且表達來源于Pangasianodonhypophthalmus的7-脫氫膽固醇還原酶。

2.如權利要求1所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于，所述7-脫氫膽固醇還原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。

3.如權利要求1或2所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于，所述釀酒酵母工程菌以釀酒酵母BY4742為宿主細胞。

4.如權利要求3所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于，所述釀酒酵母工程菌還包括啟動子，所述啟動子為強化7-脫氫膽固醇還原酶的表達；所述啟動子為PGK1p、GPM1p、TDH3p、TEF1p、TPI1p、GPD1p、TEF2p、ACT1p、GAL1p和TDH2p中的一種或多種。

5.權利要求1~4任一所述的釀酒酵母工程菌的構建方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

（1）表達盒的構建：將整合位點上游同源臂，酵母啟動子，7-脫氫膽固醇還原酶基因，酵母終止子，整合位點下游同源臂構建得到7-脫氫膽固醇還原酶表達盒元件；將得到的7-脫氫膽固醇還原酶表達盒元件以及含有Cas9蛋白的敲除質粒通過酵母轉化的方式導入到酵母細胞體內，通過酵母自身的同源重組完成元件的組裝進而得到完整的表達盒；

（2）將上述表達盒插入到釀酒酵母BY4742酵母染色體ChrXI上的1114a位點，并敲除C-22甾醇去飽和酶成功構建得到釀酒酵母工程菌。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述酵母啟動子為PGK1p、GPM1p、TDH3p、TEF1p、TPI1p、GPD1p、TEF2p、ACT1p、GAL1p和TDH2p中的一種或多種。

7.如權利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述酵母終止子為ADH1t。

8.一種生產菜油甾醇的方法，其特征在于，采用權利要求1~4任一所述的釀酒酵母工程菌制備菜油甾醇。

9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，將釀酒酵母工程菌接種至種子培養基中，制備得到種子液；將種子液轉接至發酵培養基中，收集培養后的細胞，加入皂化反應液，反應結束后加入正己烷萃取，制備得到菜油甾醇。

10.權利要求1~4任一所述的釀酒酵母工程菌在制備菜油甾醇及含有菜油甾醇的產品中的應用。