[發明專利]結核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥突變檢測試劑盒及方法

在審

• 申請號: 202110176138.7
• 申請日: 2021-02-07
• 公開（公告）號: CN112941210A
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發明（設計）人: 蔣析文;朱小亞;徐小解;侯廣山
• 申請（專利權）人: 中山大學達安基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/32
• 代理公司: 上海助之鑫知識產權代理有限公司 31328
• 代理人: 陳詳

本發明提供了一種結核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥突變檢測試劑盒及方法，具體地，本發明公開了一種基于熒光PCR熔解曲線法檢測結核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥突變的方法及試劑盒，能夠在體外快速定性檢測結核病患者的結核分枝桿菌復合群陽性的痰液培養物樣本中利福平耐藥基因rpoB和異煙肼耐藥基因katG、inhA、ahpC耐藥決定區耐藥突變。

技術領域

本發明屬于生物技術和分子診斷領域，具體地說，本發明涉及一種結核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥突變檢測試劑盒及方法。

背景技術

結核病為結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的慢性傳染性疾病。利福平(rifampicin，RIF)是利福霉素的半合成衍生物，是目前最主要的一線抗MTB藥物，該藥物通過與細菌RNA聚合酶β亞基結合干擾并抑制細菌的轉錄過程，實現殺菌效果。研究表明，約有95％以上的利福平耐藥性是由rpoB基因的81bp(編碼密碼子507-533位)的利福平耐藥決定區(rifampicin resistance determing region,RRDR)的突變包括點突變或短的插入、缺失突變等引起，使DNA依賴性RNA聚合酶β亞單位酶活性改變，利福平不能與細菌RNA聚合酶β亞單位結合而表現為耐藥。rpoB基因突變一般是單個堿基突變或數個堿基聯合突變，約80％-86％的堿基突變發生在3個氨基酸位點上，分別為531位的絲氨酸轉換為亮氨酸、526位的組氨酸轉換為酪氨酸、516位的天冬氨酸轉換為纈氨酸、酪氨酸、甘氨酸等。

異煙肼(isoniazid,INH)，是抗結核病的常用一線藥物，在結核病的治療中一直起著重要的作用。但大多數結核病患者如果長期用藥易產生耐藥性，這主要是由于長期使用INH可誘導細菌產生基因突變，從而使細菌對INH的耐藥性增強。目前已發現數個涉及異煙肼體內代謝過程中活性中間體形成有關的基因，其中katG、ahpC和inhA基因發生突變的頻度最高。異煙肼耐藥基因katG基因的3個突變密碼子309、315、316，inhA基因的2個突變密碼子-8、-15，ahpC基因的12個突變堿基-46、-44、-40，-39、-34、-32、-30、-15、-12、-10、-9、-6和3個突變密碼子2、3、5進行耐藥篩選。

MTR-TB的早期診斷和治療是目前結核病控制的熱點和難點之一。目前已有的分子生物學檢測方法有Xpert MTB/RIF系統用于結核病的快速診斷和利福平耐藥性檢測及PCR-單鏈構象多態性分析(PCR-SSCP)、限制性片段長度多態性分析(PCR-RFLP)以及基因測序(genetic sequencing)等檢測MTB耐藥基因，供臨床選擇應用。但這些方法PCR后處理操作步驟繁瑣，對技術人員要求較高，且存在一定的交叉污染，不利于廣泛推廣。

(1)Xpert MTB/RIF快速檢測利福平的耐藥性：這是一種全新的快速診斷結核病和檢測MTB耐藥性的系統，該系統針對MTB的81bp利福平耐藥核心區間設計引物、探針，并進行擴增檢測，根據其是否發生基因突變來檢測樣本中是否含有MTB及其是否對利福平耐藥，可以全自動地對樣本進行核酸提取、純化及濃縮，在2h內出結果。但是Gene-xpertMRT/RIF法出現假陰性的可能性較大，有可能導致患者被誤診為耐多藥結核病而使療程延長，不良反應增多，因此有其局限性，最終結果仍需結核菌藥敏結果證實。

(2)聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性分析(Polymerase Chain Reaction-SingleStrand Conformation Polymorphism,PCR-SSCP)：細菌的DNA基因片段在大多情況下，片段中單一堿基的置換即足以引起單鏈DNA空間構象的改變，這種改變又可導致該單鏈DNA電泳遷移率的相應變化，SSCP技術正是采用這一原理將含有突變的DNA片段與正常DNA片段通過電泳加以區分。不足之處主要是可能檢出假陰性結果，對于未知基因變異的檢測，假陰性結果就難以百分之百地消除。