[發明專利]高通量測量方法、引物及組合、試劑盒和樣本判斷方法

在審

• 申請號: 202110171921.4
• 申請日: 2021-02-05
• 公開（公告）號: CN112725439A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 鮑遠亮;楊鋒;梁萌萌;姜玥
• 申請（專利權）人: 蘇州賽福醫學檢驗有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 南京九致知識產權代理事務所(普通合伙) 32307
• 代理人: 嚴巧巧

本發明提供一種高通量測量方法、引物及組合、試劑盒和樣本判斷方法，通過設計TREC和KREC的斷點引物，其中擴增TREC時在α和δ基因簇上的signal?joint環斷點為chr14:22386826?22386826和chr14:22475315?22475315，坐標分別為chr14:21621904?22552132和chr14:22422546?22466577；其中擴增KREC時的斷點分別為chr2:88832772?88832772和chr2:88859608?88859608；在此基礎上，采用二代測序技術同時對TREC和KREC擴增產物的含量進行檢測，相互驗證，可以提高檢測的準確性和檢測效率。

技術領域

本發明涉及基因檢測領域，特別是一種全基因組變異檢測技術。

背景技術

原發性免疫缺陷病(primary immunodeficiency disease，PID)是一類由于基因缺陷造成的免疫系統損傷性疾病，多數為單基因缺陷，如不及時診治，大部分患兒將在年幼時發生反復嚴重感染，甚至死亡。隨著實驗手段不斷進步，包括DNA及RNA分析技術等，越來越多的PID建立了特異的篩查手段，包括SCID、X連鎖無丙種球蛋白血癥(XLA)及家族性噬血細胞淋巴組織細胞增生綜合征(familial hemophagocytic lymphohistiocytosis，FHL)等。其中基于TREC和KREC作為生物標記物來檢測PID成了主流方案。

TCR(T細胞受體)由4條多肽鏈α、β、γ、δ組成，每條鏈由相應的基因編碼。其基因組成包括可變區(V)、多樣區(D)、連接區(J)和恒定區(C)。TCR依多肽鏈結構及編碼基因的不同，可分為αβ-TCR和γδ-TCR兩種不同類型。大多數(約95％)為αβ-TCR，少數(約5％)為γδ-TCR。α鏈是由V、J、C基因節段編碼的肽鏈，β鏈是由V、D、J、C基因節段編碼的肽鏈。胸腺是T細胞分化、成熟的部位，從骨髓遷入胸腺的前T細胞抗原受體基因處于胚系狀態，由一系列不連續的片段構成，包括V、J、D、C區，此時無基因重排，無功能表達。在前T細胞到達胸腺后，來自不同區域的片段隨機重排，形成具有編碼功能的V-(D)-J序列。TCR-α或TCR-γ由V-J基因重排產生，TCR-β或TCR-δ由V-D-J基因重排產生。TCR基因的重排一般分為兩個階段。首先是V/J或V/D/J片段重排，結合起來形成完整的V區編碼序列。然后與編碼TCR多肽鏈C區的DNA相接合，再在RNA水平上經過轉錄，拼接形成完整和連續編碼的TCR mRNA序列(V和C區)。TCR-V基因(V/J或V/D/J)連接過程中，有兩個保守序列存在。第一個是出現在J基因5’端的由7個核苷酸組成的七聚體CACAGTG。它和V基因片段的3’端七聚體互補。第二個是J片段的七個聚體3′端相隔23個核苷酸殘基出現的九聚體TGTTTTTGG，它互補于V片段七聚體3’端相隔12個核苷酸的九聚體序列。這些保守序列以12或23個核苷酸相隔的規律出現(12/23規則)。很可能是通過七聚體、九聚體的互補而形成莖狀或環狀結構，使V-J或V-D-J序列靠攏，然后在重組酶的作用下而連接，去除莖和環部的序列，形成重排后新的DNA序列。這些被去除的DNA序列即TREC(T細胞受體切除環)。在αβT細胞中，重排TCR-α和TCR-β的基因都能產生TREC。因TCR-δ位于TCR-α位點內，所以TCRα基因重排前必須去除TCR-δ。大部分TCR-δ基因位于δRec與ψJα之間，且δRec-ψJα重排占所有δRec重排事件中的67％，因而δRec重排產生的信號和編碼連接TREC，被用于說明胸腺干細胸的功能。人類TCR-δ基因位于TCR-α基因內，在Vα與Jα基因間。由于等位基因排斥(Allelic Exclusion)機制，因此在TCRα基因重排前TCRδ基因必須被去除。在人類δRec-ψJα重排可以去除大部分的TCR-δ基因，從而為TCR-α基因重排(即Vα-Jα重排)作準備。δRec-ψJα重排產生一個信號連接TREC，Vα-Jα重排產生第二個TREC即編碼連接TREC。TREC是穩定的，在有絲分裂期間不增殖，因此隨每一次細胞分裂而被稀釋。且信號和編碼連接TREC對處女αβT細胞是特異的。于是，TREC即能作為細胞增殖歷史的標記，又能說明胸腺干細胞的活性。