[發(fā)明專利]一種積雪草干細(xì)胞的培養(yǎng)方法及其在凍干粉制備中的應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202110168640.3
• 申請日: 2021-02-07
• 公開（公告）號: CN112746054A
• 公開（公告）日: 2021-05-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李曉菊
• 申請（專利權(quán)）人: 李曉菊
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;A61K8/99;A61K8/9789;A61K8/02;A61Q19/08
• 代理公司: 重慶晶智匯知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 50229
• 代理人: 李靖

一種積雪草干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，是將積雪草莖橫切為3~5mm外植體，進行消毒處理，然后在0.6~0.8mol/L蔗糖溶液中浸泡8~12h，然后接種于緩釋培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)；所述緩釋培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中補充了6?BA、IAA、茉莉酸甲酯（MJ）、環(huán)糊精復(fù)合生長素，所述環(huán)糊精復(fù)合生長素是由環(huán)糊精包覆Cu²⁺和2,4?D的復(fù)合物。本發(fā)明培養(yǎng)的積雪草干細(xì)胞的周期短、細(xì)胞增殖快，培養(yǎng)的干細(xì)胞富含大量的積雪草苷活性成分，積雪草苷含量達(dá)到2.39%、羥基積雪草苷含量為1.42%，干細(xì)胞增殖倍數(shù)達(dá)到5.52，制備的凍干粉可以有效應(yīng)用于護膚品中，促進成纖維細(xì)胞增殖和膠原蛋白的合成。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及干細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種積雪草干細(xì)胞的培養(yǎng)方法及其在凍干粉制備中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

皮膚衰老分為內(nèi)源性衰老和外源性老化。人體每天需要更新10％的膠原蛋白，隨著年齡增長，成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白的能力下降，人體膠原蛋白的合成速度逐漸低于代謝速度，人體就會缺乏膠原蛋白，常包括皮膚在內(nèi)的各種組織器官都會逐漸衰老，此為內(nèi)源性衰老；外界因素如紫外光照射、化妝品使用不當(dāng)、物理性損傷等導(dǎo)致皮膚內(nèi)部自由基增多，破壞膠原蛋白使其崩解、斷裂，從而交聯(lián)異常，同時成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白受阻，進一步引起皮膚老化、破壞皮膚屏障功能，造成皮膚的外源性老化。

植物干細(xì)胞又稱為分生組織，是相對于植物體內(nèi)已經(jīng)分化成熟的成熟組織而言的為分化的細(xì)胞。植物分生組織根據(jù)其位置可以分為頂端分生組織和側(cè)生分生組織兩大類。其中頂端分生組織包括莖尖分生組織和根尖分生組織，側(cè)生分生組織包括維管形成層和木栓形成層。研究發(fā)現(xiàn)，植物干細(xì)胞在修復(fù)肌膚、延緩衰老方面有著超群的功效。

積雪草植物中的活性成分具有抗衰老、提高免疫力及保護心腦血管等的作用，積雪草中含有積雪草苷、積雪草酸、羥基積雪草苷和羥基積雪草酸等對皮膚具有優(yōu)異護理效果的有效成分，其中積雪草苷具有提高成纖維細(xì)胞DNA合成，促進成纖維細(xì)胞增殖、合成膠原蛋白的作用，被用于抗衰老護膚品中。但其質(zhì)量受環(huán)境因素和收獲條件的影響，活性物質(zhì)產(chǎn)量低，有些植物的活性成分僅限于特定的組織部位或生長階段合成。對于結(jié)構(gòu)復(fù)雜、人工合成困難的活性成分，傳統(tǒng)的愈傷組織培養(yǎng)方式雖然可以在短時間內(nèi)生產(chǎn)有價值的產(chǎn)品，節(jié)約了資源，但是經(jīng)歷脫分化的愈傷組織液泡化程度高，常常增加了細(xì)胞的異質(zhì)性，對振蕩培養(yǎng)的剪切力敏感，經(jīng)多次有絲分裂后，容易產(chǎn)生DNA甲基化以及轉(zhuǎn)座子被激活等變異現(xiàn)象，導(dǎo)致培養(yǎng)過程不穩(wěn)定，天然產(chǎn)物的產(chǎn)量、性質(zhì)不穩(wěn)定等缺點，難以適應(yīng)現(xiàn)代工業(yè)生產(chǎn)需求，作為草本雙子葉植物的積雪草中具有微弱的側(cè)生分生組織，因而可以提取到具有形成層的組織，因此干細(xì)胞培養(yǎng)過程中需要抑制細(xì)胞分化，使得干細(xì)胞達(dá)到值增殖不分化，同時增加有效活性成分含量是培養(yǎng)的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供一種富含積雪草苷的積雪草干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。

本發(fā)明另一目的是提供上述積雪草干細(xì)胞凍干粉的制備方法。

本發(fā)明目的通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種積雪草干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于：將積雪草莖橫切為3～5mm外植體，進行消毒，然后在0.6～0.8mol/L的蔗糖水溶液中浸泡8～12h、使得對于滲透壓敏感的非形成層組織壞死，對于滲透壓不敏感的干細(xì)胞保持活性，然后接種于緩釋培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)；上述緩釋培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其中補充了0.5～1mg/L 6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)、0.25～0.35mg/L IAA(3-吲哚乙酸)、0.2～0.4mg/L MJ(茉莉酸甲酯)、3～3.8mg/L環(huán)糊精復(fù)合生長素，所述環(huán)糊精復(fù)合生長素是由環(huán)糊精包覆Cu²⁺和2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)的復(fù)合物、使得Cu²⁺和2,4-D在培養(yǎng)基中形成緩釋。