[發明專利]一種積雪草干細胞的培養方法及其在凍干粉制備中的應用

在審

• 申請號: 202110168640.3
• 申請日: 2021-02-07
• 公開（公告）號: CN112746054A
• 公開（公告）日: 2021-05-04
• 發明（設計）人: 李曉菊
• 申請（專利權）人: 李曉菊
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;A61K8/99;A61K8/9789;A61K8/02;A61Q19/08
• 代理公司: 重慶晶智匯知識產權代理事務所(普通合伙) 50229
• 代理人: 李靖

1.一種積雪草干細胞的培養方法，其特征在于：是將積雪草莖橫切為3~5mm外植體，進行消毒，然后在0.6~0.8mol/L的蔗糖水溶液中浸泡8~12h，然后接種于緩釋培養基上進行培養；所述緩釋培養基是以MS培養基作為基礎培養基，其中補充了0.5~1mg/L 6-BA（6-芐氨基腺嘌呤）、0.15~0.25mg/L IAA（3-吲哚乙酸）、0.2~0.4mg/L MJ（茉莉酸甲酯）、3~3.8mg/L環糊精復合生長素，所述環糊精復合生長素是由環糊精包覆Cu²⁺和2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）的復合物。

2.如權利要求1所述的一種積雪草干細胞的培養方法，其特征在于：所述環糊精復合生長素是在環糊精溶液中加入硫酸銅溶液和氨水，然后依次加入生長素2,4-D、PVP，攪拌升溫至80~90℃，保溫20~30min，過濾晾干后得到環糊精包覆的Cu²⁺和2,4-D的復合生長素。

3.如權利要求1或2所述的一種積雪草干細胞的培養方法，其特征在于：所述環糊精、生長素2,4-D、硫酸銅和PVP的質量比為：3~3.8： 0.05~0.8:0.06~0.08：0.06~0.1。

4.如權利要求1-3任一項所述的一種積雪草干細胞的培養方法，其特征在于：所述消毒處理是采用體積濃度為70%的乙醇浸潤積雪草含有形成層的外植體30~40s，然后采用無菌水洗滌，再重復相同的乙醇浸潤一次，無菌水洗滌后置于50℃下加熱3~4min。

5.一種積雪草干細胞凍干粉的制備方法，其特征在于，按如下步驟進行：

S1、消毒處理：取積雪草切取莖部為3~5mm，采用體積濃度為70%的乙醇浸潤30~40s，然后采用無菌水洗滌，再重復相同的乙醇浸潤一次，無菌水洗滌后置于50℃下加熱3~4min；

S2、滲透處理：將消毒處理后的外植體在0.6~0.8mol/L蔗糖溶液中浸泡8~12h；

S3、（1）環糊精復合生長素制備：在50g/L的環糊精溶液中加入0.1~0.2mmol/L的硫酸銅溶液和過量的質量濃度為25~28%的氨水，然后依次加入生長素2,4-D、PVP，攪拌升溫至80~90℃，保溫20~30min，過濾晾干后得到環糊精包覆的Cu²⁺和2,4-D的復合生長素，環糊精、生長素2,4-D、硫酸銅和PVP質量比為3~3.8： 0.5~0.8:0.06~0.08：0.06~0.1；

（2）干細胞培養：將步驟S2處理后的外植體接種至緩釋培養基中進行干細胞的誘導和增殖培養，所述緩釋培養基是以MS培養基作為基礎培養基，其中補充了6-BA 0.5~1mg/L、IAA0.15~0.25mg/L、MJ 0.2~0.4mg/L、環糊精復合生長素3~3.8mg/L，培養溫度為25~28℃，pH為5.8~6.0；

S4、將所述干細胞急速冷卻到-50~-60℃抽真空保持2小時；然后開始升溫到-40~-30℃，保溫3~4小時，然后開始升溫到-10~-5 ℃，保溫1~2小時。