[發(fā)明專利]一種基于高通量測序的鮭科魚制品中動物源成分鑒別方法

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• 申請日: 2021-02-07
• 公開（公告）號: CN113293216A
• 公開（公告）日: 2021-08-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳穎;邢冉冉;王楠;張九凱;于寧
• 申請（專利權(quán)）人: 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京天盾知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11421
• 代理人: 宋凌林

本發(fā)明涉及食品質(zhì)量安全檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種基于高通量測序技術(shù)的鮭科魚及其制品中動物源性成分鑒別方法，包括提取基因組DNA，用帶有堿基標(biāo)簽的擴增長度為255 bp的16S rRNA通用引物對提取基因組DNA進(jìn)行PCR擴增，構(gòu)建擴增子測序文庫、高通量測序、生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析、結(jié)果評判等主要步驟。本方法可以通過一次檢測鑒別出鮭科魚及其制品中的多種動物源性成分，檢測靈敏度低至1%。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于食品質(zhì)量安全檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種基于高通量測序的鮭科魚制品中動物源性成分鑒別方法。

背景技術(shù)

鮭科(Salmonidae)隸屬于脊索動物門(Chordata)鮭形目 (Salmoniformes)，共包括3個亞科(鮭亞科、白鮭亞科和茴魚亞科)、 7個屬(大馬哈屬、紅點鮭屬、哲羅鮭屬、細(xì)鱗鮭屬、鮭屬、白鮭屬和茴 魚屬)，共約220種魚。鮭科魚是一類具有營養(yǎng)價值和保健功效的深海魚 類，味道鮮美可口，深受廣大消費者喜愛。

目前國際與國內(nèi)最常見的動物制品摻假篩查相關(guān)的核酸檢測技術(shù)是利用Sanger測序法，PCR（熒光定量PCR）方法，結(jié)合電泳（或酶切）等技術(shù)進(jìn)行檢測。但是現(xiàn)行方法通常一次只能檢測出一種或者少數(shù)幾種物種，無法實現(xiàn)未知樣品中多種源性成分的同步鑒別。當(dāng)樣本數(shù)量很大時，需要花費很大的物力和人力。另外，當(dāng)待測樣品是混合物或者未知樣品時，生物體的分離比較困難，這些現(xiàn)有的動物制品摻假鑒別技術(shù)，無論從涉及的產(chǎn)品范圍，還是從方法的適用性等方面，都遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足現(xiàn)實的需求。特別是隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，鮭科魚制品的種類越來越多，加工越來越精細(xì)，成分越來越復(fù)雜，物種的原始特征已經(jīng)消失，導(dǎo)致?lián)郊匐[蔽，難以檢測。因此，同時對多物種進(jìn)行非定向篩查的需求越來越大。而高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)極大地提高了DNA的分析效率，改變了傳統(tǒng)的分析模式，通過選擇一段合適擴增區(qū)間和長度的通用引物，可以一次性地檢測出混合樣品中的全部物種。

本發(fā)明提供了一種利用高通量測序技術(shù)對鮭科魚混合制品中的動物源性成分進(jìn)行鑒別的方法。以期為市售鮭科魚商品的種類鑒別和成分檢測等提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是建立一種基于高通量測序技術(shù)的鮭科魚制品中動物源性成分鑒別方法，可準(zhǔn)確且高效的檢測出樣品中存在的全部動物源性物種成分，具有檢測范圍廣、檢測通量高、靈敏度高等優(yōu)點。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):

（a）從待測樣品中提取基因組DNA；

（b）用帶有上下游標(biāo)記的16S rRNA通用引物對（a）中所述基因組DNA進(jìn)行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；

（c）對所述PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行純化、測定濃度；

（d）用上一步驟中達(dá)到濃度要求的PCR擴增產(chǎn)物構(gòu)建測序文庫并進(jìn)行質(zhì)量檢驗；

（e） 對上一步測序文庫進(jìn)行高通量測序，獲得16S rRNA基因片段序列；

（f） 將上一步所得16S rRNA基因片段序列與公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，根據(jù)測序序列與數(shù)據(jù)庫中已知序列的同源性確定鮭科魚制品中的動物源性物種成分。

本發(fā)明所述鮭科魚制品包括鮭科魚、鮭科魚加工品以及包含鮭科魚成分的食品。

步驟（b）中，為了在后續(xù)生物信息學(xué)分析中將不同樣品的擴增序列進(jìn)行區(qū)分，在上、下游引物的3’端前添加不同的標(biāo)記序列，用于標(biāo)識不同的DNA模板，便于將不同樣品混合測序。

步驟（b）中，16S rRNA基因擴增的正反向引物分別16SF：AYAAGACGAGAAGACCC和16SR：GATTGCGCTGTTATTCC，具體反應(yīng)條件為：94 °C預(yù)變性5 min，94 °C變性30 s，53 °C退火30 s，72 °C延伸60 s，35個循環(huán)，最后72 °C延伸10 min。