[發明專利]一種鏈霉菌分泌型表達載體及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202110167055.1
• 申請日: 2021-02-05
• 公開（公告）號: CN112852858B
• 公開（公告）日: 2022-06-24
• 發明（設計）人: 何璟;江洲;張偉
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/76
• 分類號: C12N15/76;C12N15/67;C12N15/66;C12N15/64;C12N15/62;C12N1/21;C12R1/465
• 代理公司: 武漢智嘉聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 42231
• 代理人: 易賢衛

1.一種鏈霉菌分泌型表達載體，其特征在于，所述鏈霉菌分泌型表達載體中包含如SEQID NO.1所示的序列。

2.根據權利要求1所述的一種鏈霉菌分泌型表達載體，其特征在于，所述鏈霉菌分泌型表達載體為：在載體pIJ8660的tfd基因后插入如SEQ ID NO.1所示的序列。

3.一種遺傳工程菌，其特征在于，所述遺傳工程菌包含權利要求1所述的鏈霉菌分泌型表達載體。

4.權利要求1所述的鏈霉菌分泌型表達載體或權利要求3所述的遺傳工程菌在表達并分泌外源蛋白中的應用。

5.一種權利要求1-2任一項所述的鏈霉菌分泌型表達載體的構建方法，其特征在于，所述構建方法包括：

S1、擴增得到如SEQ ID NO.2所示的強啟動子PA4基因片段，并將其與經過EcoRV和XbaI雙酶切處理的載體pIJ8660連接，轉化至感受態細胞并培養后，篩選陽性克??；

S2、合成如SEQ ID NO.3所示的分泌信號肽基因片段，并將其與經過XbaI和NotI雙酶切處理的步驟S1所述的陽性克隆連接，轉化至感受態細胞并培養后，篩選陽性克??；

S3、擴增外源目的基因，將步驟S2所述的陽性克隆經過KpnI和NotI雙酶切處理后，與外源目的基因連接；

S4、將步驟S3連接完成后的質粒轉化至感受態細胞中并篩選即得所述鏈霉菌分泌型表達載體。

6.根據權利要求5所述的構建方法，其特征在于，步驟S1中以鏈霉菌StreptomycessahachiroiATCC 33158的總DNA為模板，使用如SEQ ID NO.5-6所示的引物進行PCR擴增，得到所述強啟動子PA4基因片段。

7.根據權利要求5所述的構建方法，其特征在于，步驟S3中所述外源目的基因為如SEQID NO.4所示的融合有組氨酸標簽的綠色熒光蛋白基因片段。

8.根據權利要求7所述的構建方法，其特征在于，如SEQ ID NO.4所示的融合有組氨酸標簽的綠色熒光蛋白基因片段的擴增方法為：以載體pIJ8660為模板，使用如SEQ ID NO.7-8所示的引物擴增得到。

9.一種外源蛋白的分泌表達方法，其特征在于，所述方法包括：按照如權利要求5所述的構建方法構建得到表達載體，將所述表達載體轉化至大腸桿菌中培養，然后導入至變鉛青鏈霉菌ZX1中，得到可表達并分泌外源蛋白的重組菌株。