[發(fā)明專利]一種鏈霉菌分泌型表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110167055.1
• 申請(qǐng)日: 2021-02-05
• 公開（公告）號(hào): CN112852858B
• 公開（公告）日: 2022-06-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何璟;江洲;張偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/76
• 分類號(hào): C12N15/76;C12N15/67;C12N15/66;C12N15/64;C12N15/62;C12N1/21;C12R1/465
• 代理公司: 武漢智嘉聯(lián)合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 42231
• 代理人: 易賢衛(wèi)

本發(fā)明公開了一種鏈霉菌分泌型表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明提供了一種鏈霉菌分泌型表達(dá)載體，所述鏈霉菌分泌型表達(dá)載體中包含如SEQ ID NO.1所示的序列，該表達(dá)載體具體為：將強(qiáng)啟動(dòng)子PA4以及特定的分泌信號(hào)肽與待表達(dá)目的基因N端融合，并插入至常規(guī)載體中構(gòu)建得到重組質(zhì)粒，可使目的基因表達(dá)并將表達(dá)的目的蛋白分泌至胞外，在重組菌株的發(fā)酵培養(yǎng)過程中，可以直接從發(fā)酵液中收集得到分泌表達(dá)的外源目的蛋白。所述載體的構(gòu)建方法簡(jiǎn)單快速，并且可直接將目的蛋白分泌至胞外，利于目的蛋白的收集，避免了異源蛋白積累造成的細(xì)胞毒性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鏈霉菌分泌型表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

蛋白類產(chǎn)品如酶類、血紅蛋白、抗體等在日常生活中的需求龐大。天然來(lái)源的蛋白表達(dá)水平較低，嚴(yán)重限制了蛋白類產(chǎn)品的發(fā)展，而隨著基因工程技術(shù)的興起，異源表達(dá)系統(tǒng)的開發(fā)有效提高了蛋白的產(chǎn)量，使得目前重組蛋白在化工、燃料、食品等領(lǐng)域已經(jīng)具有了較高的市場(chǎng)占有率，尤其是生物醫(yī)藥類蛋白蘊(yùn)含著具大的生產(chǎn)潛力和商業(yè)價(jià)值。

在表達(dá)異源蛋白時(shí)，選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)十分關(guān)鍵。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)最早被開發(fā)且目前應(yīng)用最為廣泛，具有培養(yǎng)價(jià)格低、生長(zhǎng)迅速、易操作、表達(dá)水平高等優(yōu)點(diǎn)，其使用局限在于表達(dá)水平過高易形成包涵體以及缺少翻譯后修飾。與原核表達(dá)系統(tǒng)相比，真核表達(dá)系統(tǒng)的種類更加豐富，包括酵母、絲狀真菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)等。在表達(dá)特定來(lái)源如鏈霉菌屬或古細(xì)菌的蛋白時(shí)，常用的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)往往效果不佳。

革蘭氏陽(yáng)性菌鏈霉菌不僅是許多藥用抗生素的產(chǎn)生菌，還可以分泌不同種類的蛋白，包括酶和酶的抑制劑，從而保證自身在環(huán)境中的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。鏈霉菌具有強(qiáng)大的分泌系統(tǒng)，較低的內(nèi)源蛋白水解酶活性，極低的外源DNA修飾限制系統(tǒng)，培養(yǎng)條件完善，遺傳操作方法成熟。此外，它還可以幫助異源蛋白翻譯后的折疊，促進(jìn)蛋白分泌到胞外，極低的內(nèi)源毒性，可用于食品與藥品的發(fā)酵，具有成為蛋白表達(dá)宿主菌的應(yīng)用潛力。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種鏈霉菌分泌型表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，將強(qiáng)啟動(dòng)子PA4以及特定的分泌信號(hào)肽融合至目的基因的N端，并插入至常規(guī)載體中構(gòu)建得到重組質(zhì)粒，即鏈霉菌分泌型表達(dá)載體，該載體可表達(dá)目的蛋白并將其分泌至胞外；將該重組質(zhì)粒通過大腸桿菌-鏈霉菌屬間接合轉(zhuǎn)移或原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入變鉛青鏈霉菌ZX1(Streptomyces lividans ZX1)中，獲得重組菌株，對(duì)該重組菌株進(jìn)行培養(yǎng)，從發(fā)酵液中即可收集得到分泌表達(dá)的外源目的蛋白，所述載體的構(gòu)建方法簡(jiǎn)單快速，并且可直接將目的蛋白分泌至胞外，利于目的蛋白的收集，避免了異源蛋白積累造成的細(xì)胞毒性。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種鏈霉菌分泌型表達(dá)載體，所述鏈霉菌分泌型表達(dá)載體中包含如SEQ ID NO.1所示的序列。

進(jìn)一步的，所述鏈霉菌分泌型表達(dá)載體為：在載體pIJ8660的tfd基因后插入如SEQID NO.1所示的序列。

本發(fā)明還提供了一種遺傳工程菌，所述遺傳工程菌包含權(quán)利要求1所述的鏈霉菌分泌型表達(dá)載體。

本發(fā)明還提供了上述鏈霉菌分泌型表達(dá)載體或上述遺傳工程菌在表達(dá)并分泌外源蛋白中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述鏈霉菌分泌型表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括：

S1、擴(kuò)增得到如SEQ ID NO.2所示的強(qiáng)啟動(dòng)子PA4基因片段，并將其與經(jīng)過EcoRV和XbaI雙酶切處理的載體pIJ8660連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞并培養(yǎng)后，篩選陽(yáng)性克隆；

S2、合成如SEQ ID NO.3所示的分泌信號(hào)肽基因片段，并將其與經(jīng)過XbaI和NotI雙酶切處理的步驟S1所述的陽(yáng)性克隆連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞并培養(yǎng)后，篩選陽(yáng)性克隆；