[發(fā)明專(zhuān)利]一種用于檢測(cè)副溶血性弧菌DNA的反應(yīng)體系、試劑盒及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110166903.7
• 申請(qǐng)日: 2021-02-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112831580B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 呂鵬;黃棟;潘曄;劉蕊;裘宋琳;聶小娟;陳克平;陳全勝
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江蘇大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/689
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11
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本發(fā)明屬于病原診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)副溶血性弧菌DNA的反應(yīng)體系、試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明利用SHERLOCK技術(shù)建立了一種快速檢測(cè)致病性副溶血性弧菌的檢測(cè)方法，該方法可檢測(cè)副溶血性弧菌的tlh基因、tdh基因、trh基因和toxR基因四種致病基因，特異性強(qiáng)，靈敏度高，并且操作簡(jiǎn)便快捷，結(jié)果讀取準(zhǔn)確迅速，克服了現(xiàn)有檢測(cè)方法檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)且靈敏度不夠高的問(wèn)題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于病原診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)副溶血性弧菌DNA的反應(yīng)體系、試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

副溶血性弧菌（Vibrio?parahaemolyticus，VP）是一種廣泛存在于海洋和鹽湖中的嗜鹽致病菌，致病力強(qiáng)，臨床上以急性起病、腹痛、嘔吐、腹瀉及水樣便為主要癥狀，患者病后免疫力不強(qiáng)，可重復(fù)感染，嚴(yán)重者可發(fā)生休克。流行病學(xué)調(diào)查顯示，由副溶血性弧菌感染引起的食物中毒在世界范圍內(nèi)引起了多次食源性公共衛(wèi)生事件，對(duì)人類(lèi)健康狀況構(gòu)成了威脅。研究發(fā)現(xiàn)，溶血毒素是引起副溶血性弧菌致病性的主要因素，其中溶血毒素包括耐熱直接溶血素（TDH）、耐熱直接溶血素相關(guān)溶血素（TRH）和不耐熱溶血素（TLH）。副溶血性弧菌的主要毒力因子有TLH、TDH和TRH。TLH是一種非典型的磷脂酶，能溶解人的紅細(xì)胞，具有副溶血性弧菌種屬的特異性。TDH能在我妻氏血平板上引起β－溶血(神奈川現(xiàn)象)，具有致死毒性、心臟毒性、細(xì)胞毒性和腸毒素作用。TRH雖不能引起神奈川現(xiàn)象，但其與TDH有相似的免疫原性和?67%?的相同氨基酸序列，并同樣具有致死作用和細(xì)胞毒性。而 toxR基因是近年來(lái)在副溶血性弧菌中新發(fā)現(xiàn)的致病基因，與副溶血性弧菌的毒力和致病性密切相關(guān)。

現(xiàn)有副溶血性弧菌檢測(cè)方法主要有PCR檢測(cè)法、Elisa檢測(cè)法、免疫膠體金?(ICG)檢測(cè)法、核酸序列恒溫?cái)U(kuò)增(NASBA)檢測(cè)法等。在實(shí)際樣品檢測(cè)工作中，現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)主要存在的問(wèn)題一是靈敏度不夠高，無(wú)法檢測(cè)到潛伏感病樣品；二是容易產(chǎn)生假陽(yáng)性，對(duì)模板質(zhì)量要求高；三是操作繁瑣，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求高，不利于一線(xiàn)技術(shù)人員操作。

SHERLOCK是一種新型的等溫核酸檢測(cè)技術(shù)，即利用Crispr-Cas13a反應(yīng)系統(tǒng)，將Cas13a的附帶切割作用與等溫?cái)U(kuò)增相結(jié)合，以建立基于CRISPR的診斷平臺(tái)（CRISPR-Dx），可實(shí)現(xiàn)具有渺摩爾（aM）靈敏度和單堿基錯(cuò)配特異性的快速DNA或RNA檢測(cè)。SHERLOCK反應(yīng)可在5~60min之內(nèi)實(shí)現(xiàn)致病菌的檢測(cè)，在37~42?℃即可進(jìn)行快速、高靈敏度的檢測(cè)，擺脫了恒溫?cái)U(kuò)增設(shè)備的束縛。整個(gè)反應(yīng)過(guò)程使用熒光讀取器進(jìn)行熒光值的讀取，具有安全、快捷、高效的特點(diǎn)，此外，SHERLOCK反應(yīng)試劑可凍干，具有冷鏈獨(dú)立性和長(zhǎng)期保存、易于推廣等特點(diǎn)。目前尚未出現(xiàn)SHERLOCK技術(shù)應(yīng)用在副溶血性弧菌檢測(cè)的相關(guān)研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中所存在的缺陷，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)副溶血性弧菌核酸的反應(yīng)體系、試劑盒及其應(yīng)用。利用SHERLOCK技術(shù)建立了一種快速檢測(cè)致病性副溶血性弧菌的檢測(cè)方法，該方法可檢測(cè)副溶血性弧菌的四種致病基因，特異性強(qiáng)，靈敏度高，并且操作簡(jiǎn)便快捷，結(jié)果讀取準(zhǔn)確迅速，克服了現(xiàn)有檢測(cè)方法檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)且靈敏度不夠高的問(wèn)題，適用于食品、水樣、糞便、嘔吐物、增菌液等多樣本中副溶血性弧菌的定性檢測(cè)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供一種用于檢測(cè)副溶血性弧菌核酸的反應(yīng)體系，該反應(yīng)體系為SHERLOCK反應(yīng)體系，其包括用于擴(kuò)增目的核酸片段的引物組和/或?qū)?yīng)的crRNA；所述目的核酸片段包括tlh基因、tdh基因、toxR基因和/或trh基因中的一種或多種。

其中，所述tlh基因的引物對(duì)如SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示，所述tlh基因的crRNA如SEQ?ID?NO：3所示；

所述tdh基因的引物對(duì)如SEQ?ID?NO：4和SEQ?ID?NO：5所示，所述tdh基因的crRNA如SEQ?ID?NO：6所示；