[發(fā)明專利]一種用于檢測副溶血性弧菌DNA的反應(yīng)體系、試劑盒及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110166903.7
• 申請日: 2021-02-04
• 公開（公告）號(hào): CN112831580B
• 公開（公告）日: 2023-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 呂鵬;黃棟;潘曄;劉蕊;裘宋琳;聶小娟;陳克平;陳全勝
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.?一種用于檢測副溶血性弧菌DNA的反應(yīng)體系，其特征在于，所述反應(yīng)體系為SHERLOCK反應(yīng)體系，其包括用于擴(kuò)增目的核酸片段的特異性引物對(duì)和對(duì)應(yīng)的crRNA；所述目的核酸片段為tlh基因、tdh基因、toxR基因和trh基因；所述特異性引物對(duì)包括如SEQ?IDNO：1和SEQ?ID?NO：2所示的tlh基因引物序列、如SEQ?ID?NO：4和SEQ?ID?NO：5所示的tdh基因引物序列、如SEQ?ID?NO：7和SEQ?ID?NO：8所示的toxR基因引物序列、如SEQ?ID?NO：10和SEQ?ID?NO：11所示的trh基因引物序列；所述crRNA序列用于結(jié)合擴(kuò)增后的所述目的核酸片段轉(zhuǎn)錄的ssRNA，所述crRNA為4條，分別為如SEQ?ID?NO：3所示的tlh基因crRNA、SEQ?ID?NO6所示的tdh基因crRNA、SEQ?ID?NO：9所示的toxR基因crRNA、SEQ?ID?NO12所示的trh基因crRNA。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反應(yīng)體系，其特征在于，所述的反應(yīng)體系中各引物對(duì)的濃度為10~20μM，所述crRNA的濃度為22.5~30nM。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的反應(yīng)體系，其特征在于，所述反應(yīng)體系還包含有熒光標(biāo)記分子，所述熒光標(biāo)記分子的濃度為250~300nM。

4.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的反應(yīng)體系，其特征在于，所述反應(yīng)體系還包含有?ReactionBuffer，Basic?E-mix，Core?Reaction?Mix，純化的LwCas13a蛋白，RNase抑制劑，T7?RNA?聚合酶，NTP?Mixture，dNTP?Mixture和Mg²⁺。

5.一種用于檢測副溶血性弧菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含如權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的用于檢測副溶血性弧菌的反應(yīng)體系。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括核酸提取試劑和陰性對(duì)照。

7.一種非診斷目的的檢測副溶血性弧菌的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）使用核酸提取試劑提取待檢樣品中的核酸；

（2）以步驟（1）提取的核酸為模板，采用如權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的反應(yīng)體系進(jìn)行SHERLOCK反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為30~90min、反應(yīng)溫度為37～42℃，反應(yīng)結(jié)束后分析檢測結(jié)果。

8.權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的用于檢測副溶血性弧菌的反應(yīng)體系在制備用于檢測副溶血性弧菌的試劑中的應(yīng)用。