[發(fā)明專利]一種樂(lè)伐替尼耐藥基因NF1、其篩選方法及應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110165911.X
• 申請(qǐng)日: 2021-02-03
• 公開（公告）號(hào): CN113005125A
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫一帆;陳坤;沈永奇;盧永剛;張潔;何沙;孫林;黃文杰;肖笑榮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 柳州市柳鐵中心醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N15/12
• 分類號(hào): C12N15/12;C12N15/867;C12N15/10;C12Q1/02
• 代理公司: 南寧新途專利代理事務(wù)所(普通合伙) 45119
• 代理人: 朱肖鳳

本發(fā)明涉及腫瘤耐藥基因技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種樂(lè)伐替尼耐藥基因NF1、其篩選方法及應(yīng)用，NF1的基因的序列為SEQ ID NO：1。其篩選方法包括以下步驟：進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，獲得sgRNA文庫(kù)的最佳MOI，確定樂(lè)伐替尼的濃度；進(jìn)行感染Cas9文庫(kù)實(shí)驗(yàn)，得到穩(wěn)定株；穩(wěn)定株加入樂(lè)伐替尼處理，通過(guò)PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序，分析sgRNA的富集情況；篩選樂(lè)伐替尼耐藥基因；有效靶基因?qū)Ω伟┘?xì)胞功能表型及介導(dǎo)樂(lè)伐替尼耐藥的作用驗(yàn)證。本發(fā)明通過(guò)CRISPR/Cas9全基因文庫(kù)篩選得到樂(lè)伐替尼的耐藥基因，為今后減少樂(lè)伐替尼耐藥性提供了理論依據(jù)，為樂(lè)伐替尼的臨床應(yīng)用提供了新的耐藥靶點(diǎn)，為臨床合理用藥提供指導(dǎo)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及腫瘤耐藥基因技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種樂(lè)伐替尼耐藥基因NF1、其篩選方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在我國(guó)所有腫瘤中位居第三，死亡率高居第二位。2018年9月4日樂(lè)伐替尼在中國(guó)上市，用于晚期肝癌的一線治療在中國(guó)上市，用于晚期肝癌的一線治療在中國(guó)上市，用于晚期肝癌的一線治療，樂(lè)伐替尼正式取代索拉非尼成為國(guó)際上晚期肝癌一線治療的首選藥物，是小分子多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，主要作用于是小分子多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，樂(lè)伐替尼主要作用于是小分子多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，同時(shí)具有抗腫瘤細(xì)胞增殖及抗血管生成作用，靶向藥物耐藥的主要機(jī)制包括腫瘤建立代償信號(hào)通路、靶蛋白改變、腫瘤微環(huán)境變化、腫瘤異質(zhì)性產(chǎn)生和腫瘤對(duì)靶向藥物的適應(yīng)等，不同的分子靶向藥物可能同時(shí)具有多種耐藥機(jī)制，毫無(wú)疑問(wèn)，分子靶向治療為腫瘤患者提供了生存和預(yù)后獲益，但耐藥也是分子靶向藥物面臨的主要問(wèn)題。目前對(duì)于樂(lè)伐替尼長(zhǎng)期使用后產(chǎn)生的耐藥性，尚未見報(bào)道，因此，積極探索樂(lè)伐替尼的耐藥靶基因，對(duì)于減少樂(lè)伐替尼耐藥，指導(dǎo)臨床用藥有著重要意義。

以往，藥物耐藥基因常用RNAi文庫(kù)進(jìn)行高通量篩選。但RNAi技術(shù)造成的表型變化不夠穩(wěn)定、明顯，且細(xì)胞內(nèi)源性的RNAi途徑導(dǎo)致RNAi篩選存在著廣泛的脫靶效應(yīng)。CRISPR/Cas9 作為一種強(qiáng)大的基因組編輯工具，可以對(duì)基因進(jìn)行完全敲除，為高通量篩選帶來(lái)了革命性技術(shù)。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建靶向全基因組范圍的CRISPR/Cas9敲除文庫(kù)，可實(shí)現(xiàn)全基因組范圍的高通量篩選，能夠快速產(chǎn)生功能缺失的突變體并且篩選所期望的表型，進(jìn)而找出候選基因。與 RNAi技術(shù)相比，CRISPR/Cas9敲除文庫(kù)具有相對(duì)較低的脫靶效率和更廣泛的作用位點(diǎn)，因而逐漸成為功能性基因篩選的熱點(diǎn)方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種樂(lè)伐替尼耐藥基因NF1、其篩選方法及應(yīng)用。

一種樂(lè)伐替尼耐藥基因NF1，該基因的序列為SEQ ID NO：1。

樂(lè)伐替尼耐藥基因NF1的篩選方法為使用HuH7細(xì)胞株作為目的細(xì)胞，利用CRISPR-Cas9 的高通量功能性篩選技術(shù)進(jìn)行樂(lè)伐替尼耐藥的差異靶基因篩選，包括以下步驟：

步驟一：進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，獲得sgRNA文庫(kù)的最佳MOI，確定樂(lè)伐替尼的濃度；

步驟二：進(jìn)行感染Cas9文庫(kù)實(shí)驗(yàn)，得到穩(wěn)定株；

步驟三：穩(wěn)定株加入樂(lè)伐替尼處理，通過(guò)PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序，分析sgRNA的富集情況；

步驟四：篩選樂(lè)伐替尼耐藥基因；

步驟五：有效靶基因?qū)Ω伟┘?xì)胞功能表型及介導(dǎo)樂(lè)伐替尼耐藥的作用驗(yàn)證。

進(jìn)一步地，預(yù)實(shí)驗(yàn)包括：細(xì)胞感染預(yù)實(shí)驗(yàn)、低MOI感染預(yù)實(shí)驗(yàn)-熒光、低MOI感染預(yù)實(shí)驗(yàn)-抗性、樂(lè)伐替尼藥物濃度預(yù)實(shí)驗(yàn)。

具體地，細(xì)胞感染預(yù)實(shí)驗(yàn)包括：用包裝好的GFP慢病毒感染目的細(xì)胞，觀察不同MOI值下的感染效率，以確定sgRNA文庫(kù)的最佳MOI；