[發(fā)明專利]一種樂伐替尼耐藥基因NF1、其篩選方法及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110165911.X
• 申請日: 2021-02-03
• 公開（公告）號(hào): CN113005125A
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫一帆;陳坤;沈永奇;盧永剛;張潔;何沙;孫林;黃文杰;肖笑榮
• 申請（專利權(quán)）人: 柳州市柳鐵中心醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N15/12
• 分類號(hào): C12N15/12;C12N15/867;C12N15/10;C12Q1/02
• 代理公司: 南寧新途專利代理事務(wù)所(普通合伙) 45119
• 代理人: 朱肖鳳

1.一種樂伐替尼耐藥基因NF1，其特征在于：該基因的序列為SEQ ID NO：1。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種樂伐替尼耐藥基因NF1的篩選方法，其特征在于：使用HuH7細(xì)胞株作為目的細(xì)胞，利用CRISPR-Cas9的高通量功能性篩選技術(shù)進(jìn)行樂伐替尼耐藥的差異靶基因篩選，該方法包括以下步驟：

步驟一：進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，獲得sgRNA文庫的最佳MOI，確定樂伐替尼的濃度；

步驟二：進(jìn)行感染Cas9文庫實(shí)驗(yàn)，得到穩(wěn)定株；

步驟三：穩(wěn)定株加入樂伐替尼處理，通過PCR擴(kuò)增和高通量測序，分析sgRNA的富集情況；

步驟四：篩選樂伐替尼耐藥基因；

步驟五：有效靶基因?qū)Ω伟┘?xì)胞功能表型及介導(dǎo)樂伐替尼耐藥的作用驗(yàn)證。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種樂伐替尼耐藥基因NF1的篩選方法，其特征在于：

預(yù)實(shí)驗(yàn)包括：細(xì)胞感染預(yù)實(shí)驗(yàn)、低MOI感染預(yù)實(shí)驗(yàn)-熒光、低MOI感染預(yù)實(shí)驗(yàn)-抗性、樂伐替尼藥物濃度預(yù)實(shí)驗(yàn)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種樂伐替尼耐藥基因NF1的篩選方法，其特征在于：

細(xì)胞感染預(yù)實(shí)驗(yàn)包括：用包裝好的GFP慢病毒感染目的細(xì)胞，觀察不同MOI值下的感染效率，以確定sgRNA文庫的最佳MOI；

低MOI感染預(yù)實(shí)驗(yàn)-熒光包括：以12孔板每孔3E6的細(xì)胞量接種靶細(xì)胞于培養(yǎng)皿中，病毒原液從-80℃冰箱取出后冰浴融化，用含5μg/mL Polybrene的新鮮培養(yǎng)基按MOI分別為0.3，0.5，1和2稀釋帶有GFP的病毒原液，將含有慢病毒稀釋液加到對(duì)應(yīng)細(xì)胞中，離心感染2h；感染6h后，將細(xì)胞傳出到6cm皿中，感染48h后，收細(xì)胞進(jìn)行流式檢測；

低MOI感染預(yù)實(shí)驗(yàn)-抗性包括：以12孔板每孔3E6的細(xì)胞量接種靶細(xì)胞于培養(yǎng)皿中，病毒原液從-80℃冰箱取出后冰浴融化，用含5μg/mL Polybrene的新鮮培養(yǎng)基按MOI分別為0.3，0.5，1和2稀釋Cas9sgRNA文庫的病毒原液，將含有慢病毒稀釋液加到對(duì)應(yīng)細(xì)胞中，離心感染2h；感染6h后，將細(xì)胞傳出到6cm皿中；感染48h后，使用Puro篩選細(xì)胞48h，計(jì)數(shù)；

樂伐替尼藥物濃度預(yù)實(shí)驗(yàn)包括：將細(xì)胞接種到96孔板種，每孔細(xì)胞量為5W，接種細(xì)胞后第二天，加入濃度為10mM的樂伐替尼母液，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量隨藥物濃度加入量的變化指標(biāo)，選擇細(xì)胞變化量最小的濃度作為下一步實(shí)驗(yàn)所使用的樂伐替尼濃度。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種樂伐替尼耐藥基因NF1的篩選方法，其特征在于：感染Cas9文庫實(shí)驗(yàn)包括：

1)用包裝好的lentiCas9-Blast慢病毒感染HuH7細(xì)胞，使用殺稻瘟菌素并得到HuH7-Cas9穩(wěn)定株；

2)擴(kuò)增HuH7-Cas9穩(wěn)定株細(xì)胞，再感染sgRNA文庫慢病毒。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種樂伐替尼耐藥基因NF1的篩選方法，其特征在于：穩(wěn)定株加入樂伐替尼處理，通過PCR擴(kuò)增和高通量測序，分析sgRNA的富集情況包括：使用樂伐替尼處理上游嘌呤霉素篩選7天后的細(xì)胞；將上游細(xì)胞等分為兩份，一份為0天對(duì)照組，另一份為樂伐替尼組；0天對(duì)照組收樣，凍存在-80℃；樂伐替尼組持續(xù)加藥篩選，共篩選21天，期間正常換液或傳代，21天后，樂伐替尼抗性細(xì)胞得到富集，收樣提取DNA；使用特異性引物擴(kuò)增目的產(chǎn)物并回收，檢測PCR效果，進(jìn)行二代測序，對(duì)以上每個(gè)樣本中的每一種sgRNAreads富集數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)各樣本中不同sgRNA對(duì)應(yīng)的基因上富集到的reads數(shù)，對(duì)不同樣本的比較組合的sgRNA富集的reads進(jìn)行聚類分析，根據(jù)sgRNA富集的reads支持?jǐn)?shù)差異篩選出候選基因后，富集分析研究候選基因在GeneOntology中的分布狀況以闡明實(shí)驗(yàn)中樣本候選在基因功能上的體現(xiàn)。