[發(fā)明專利]一種淫羊藿、巴戟復(fù)方提取液的研究方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110165337.8
• 申請日: 2021-02-06
• 公開（公告）號: CN112957400A
• 公開（公告）日: 2021-06-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃文柱;陳仰新;楊安平
• 申請（專利權(quán)）人: 佛山市第五人民醫(yī)院;佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院
• 主分類號: A61K36/746
• 分類號: A61K36/746;A61P15/10;A61P15/08;A61P29/00;A61P19/08;A61P21/00;A61P5/26;G01N30/02;G01N33/15
• 代理公司: 東莞市科安知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44284
• 代理人: 王勇剛

1.一種淫羊藿、巴戟復(fù)方提取液的研究方法，其特征在于，包括如下過程：

S1、淫羊藿、巴戟復(fù)方提取液的制備：取淫羊藿、巴戟各1000g粗粉，加50％乙醇按滲漉法滲漉，收集滲漉液，回收乙醇，加水850ml，濾過，濾液加糖100g、蜂蜜50g，溶解過濾，濾液加防腐劑適量，加水至1000ml，攪勻，分裝，滅菌，即得；

S2、淫羊藿甙含量測定：(1)對照品溶液制備：精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的淫羊藿甙對照品1.68mg，置25ml量瓶中，加甲醇13ml使溶解，加水稀釋至刻度，即得；(2)供試品溶液制備：精密吸取樣品1ml，加水4ml，用乙酸乙酯萃取3次，分別為20、20、15ml，合并醋酸乙酯溶液，蒸干，加甲醇13ml溶解，移至25ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，放置30min，濾過，即得；(3)空白溶液的制備：取缺淫羊藿甙藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法處理；

S3、測定過程：(1)取對照品溶液、供試品溶液、空白溶液、供試品溶液和對照品溶液的混合液，按色譜條件分別進樣測定；(2)取不同量的對照品溶液進行測定；

S4、精密度試驗：精密吸取同一樣品溶液，重復(fù)進樣5次，進樣10ul；

S5、穩(wěn)定性試驗：同一批樣品制成供試品溶液，當(dāng)天進行含量測定，5天后再測定；

S6、重復(fù)性試驗：同一批樣品取5份，分別按含量測定方法測定；

S7、加樣回收率試驗：取已知含量的同一批樣品，各定量加入對照品適量，然后按供試品溶液制備方法制備樣品溶液，依法測定含量，計算回收率；

S8、不同乙醇濃度提取淫羊藿甙含量比較：精密稱取淫羊藿粉各5g，分別精密加入35％、50％、70％、95％乙醇各50ml，精密稱定，超聲處理lh，原濃度乙醇補充減失量，濾過，各精密吸取5ml，分別水浴蒸干，各加52％甲醇，分別移人lOml量瓶中，用52％甲醇分別稀釋至刻度，搖勻，放置30min，濾過，取濾液按銀天口服液淫羊藿甙含量測定方法測定；

S9、供試液提取：(1)樣品液：每毫升含淫羊藿：巴戟為1：1，相當(dāng)于生藥2g；(2)人參提取液：取紅參去蘆頭，加水浸過藥面，隔水加熱提取兩次，過濾，合并兩次濾液，濃縮，配成含生藥0.5g/ml的供試液；(3)鹽酸普萘洛爾片：現(xiàn)有的鹽酸普萘洛爾片臨時配成混懸液；(4)己烯雌酚片：現(xiàn)有的己烯雌酚片臨時配成混懸液；(5)甲基睪丸素片：現(xiàn)有的甲基睪丸素片臨時配成混懸液；

S10、急性毒性試驗：取18-20g小白鼠15只，雌雄兼用，間隔1.5h分兩次灌胃給供試液，觀察7天；

S11、常壓耐缺氧試驗：取18-22g小白鼠,雌雄兼用,隨機分設(shè)為4組,每組分別灌胃給予等體積的供試液，對照組為蒸餾水，連續(xù)7天，于末次給藥后1h將小白鼠放入內(nèi)裝10g鈉石灰的250ml廣口瓶中，每瓶1只,瓶口涂凡士林密封，以死亡為指標，立即計算動物的存活時間；

S12、抗疲勞試驗：取18-22g小白鼠，雌雄兼用,隨機分設(shè)4組,每組分別灌胃給予等體積供試液，對照組為蒸餾水，連續(xù)14天，末次給藥后1h按體重的5％尾部負重，然后放入水深20cm、水溫20℃的常水中立即計時，至小白鼠沉入水底死亡為止，記錄時間；

S13、交配能力試驗：取27-35g雄性小白鼠，隨機分設(shè)4組，其中對照組為11只；樣品高劑量組為10只、樣品低劑量組為11只；甲基睪丸素組為16只；每組分別灌胃給予等體積的供試液，連續(xù)7天，于給藥的第4天，取成熟的雌性小白鼠，灌胃給予己烯雌酚混懸液，連續(xù)3天，第3天陰道涂片檢查，取動情期的雌鼠與上述給藥雄性小白鼠按3：1合籠,合籠后早晚檢查雌鼠陰栓,每天將受配的雌鼠取出,補入新的雌鼠，使雌雄比例保持3：1，連續(xù)觀察3天，記錄每天受配雌鼠數(shù)，樣品高劑量組、樣品低劑量組、甲基睪丸素組與對照組進行X²檢驗比較。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種淫羊藿、巴戟復(fù)方提取液的研究方法，其特征在于，所述S1制備后的淫羊藿、巴戟復(fù)方提取液為深棕紅色，較粘稠，放置后有少量沉淀。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種淫羊藿、巴戟復(fù)方提取液的研究方法，其特征在于，在所述S3的測定過程中，取對照品溶液10ul注人液相色譜儀，記錄色譜圖峰面積，另取供試品溶液10ul，同法測定，按外標法以峰面積計算，計算公式：淫羊藿甙含量＝樣品溶液峰面積×對照品溶液濃度×稀釋倍數(shù)÷[對照品溶液峰面積×取樣量]。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種淫羊藿、巴戟復(fù)方提取液的研究方法，其特征在于，在所述S3的測定過程中，流動相：乙腈(色譜純)-水-醋酸的比為25：75：4；流速：lml/min；柱溫：室溫；檢測波長：270nm；靈敏感：0.02AuFs；進樣量：10ul，淫羊藿甙主峰保留時間為31min。