[發明專利]一種高立體選擇性的甲硫氨酸腺苷轉移酶及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 202110163535.0
• 申請日: 2021-02-05
• 公開（公告）號: CN112760303B
• 公開（公告）日: 2023-06-20
• 發明（設計）人: 馬龍;任思羽;程新寬;滿淑麗
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12P13/12;C12P19/40
• 代理公司: 蘇州達權專利代理事務所(普通合伙) 32737
• 代理人: 溫明霞

本發明公開了一種高立體選擇性的甲硫氨酸腺苷轉移酶及其制備方法與應用，通過提取星海鏈霉菌的基因組；以基因組為DNA模板，采用PCR擴增技術，得到星海鏈霉菌中的甲硫氨酸腺苷轉移酶的基因序列即metK目的片段；將metK目的片段與表達載體pET?32a(+)進行雙酶切后連接，構建重組質粒；采用熱激化法將重組質粒轉化到大腸桿菌BL21的感受態細胞中，并經過異丙基?β?D?硫代半乳糖苷誘導表達，得到SxMAT；通過對高立體選擇性的甲硫氨酸腺苷轉移酶進行變性后復性的方式，得到高純度的SxMAT，所述SxMAT在溫度為25?55℃，pH值為8?10.5時穩定性好，且產物的光學純度(ee)90％，產率為80％，SxMAT與氟化酶聯用構建體外雙酶級聯反應，有益于人們對鏈霉菌中氟化通路的理解以及衍生對氟化天然產物的應用。

技術領域

本發明屬于蛋白質與酶工程技術領域，具體涉及一種高立體選擇性的甲硫氨酸腺苷轉移酶及其制備方法與應用。

背景技術

S-腺苷-L-甲硫氨酸，即S-腺苷甲硫氨酸，常用縮寫方式包括SAM、SAM-e和AdoMet。在生物體內，S-腺苷甲硫氨酸是以L-甲硫氨酸(L-Met)和三磷酸腺苷(ATP)為底物，在甲硫氨酸腺苷轉移酶也叫S-腺苷-L-甲硫氨酸合成酶(MAT,EC?2.5.1.6)的催化下形成的。在此反應中，首先生成S-腺苷-L-甲硫氨酸和三聚磷酸鹽；隨后，得到的三聚磷酸鹽被不對稱水解，產生焦磷酸鹽(ppi)和正磷酸鹽(pi)。S-腺苷-L-甲硫氨酸廣泛存在于動物、植物和微生物體內，參與生物體內40多種生化反應，是生物體內重要的生理活性物質。S-腺苷-L-甲硫氨酸作為一種重要代謝中間化合物，通過轉甲基、轉硫基和轉氨丙基等反應參與人體眾多代謝途徑，是保證人體正常生命活動所不可或缺的重要物質。臨床研究表明，S-腺苷-L-甲硫氨酸對肝臟疾病、抑郁癥、關節炎等許多疾病具有治療效果，同時，S-腺苷-L-甲硫氨酸是細胞內原有的代謝物，具有易吸收、副作用小等特點。1999年，美國FDA批準S-腺苷-L-甲硫氨酸以SAM-e為名字，作為膳食補充劑在美國上市。近年來，國內外嘗試用S-腺苷-L-甲硫氨酸對肝臟疾病、抑郁癥等進行治療，并獲得一定成效，使其市場需求不斷擴大。

S-腺苷-L-甲硫氨酸的制備始于上世紀50年代，主要有化學合成法，微生物發酵法和酶催化法三種。相比于化學合成法和微生物發酵法，酶催化法因具有立體選擇性高、反應條件溫和、反應時間短、產物易分離、對環境友好等特點，成為近年來研究S-腺苷-L-甲硫氨酸制備的熱點方向。迄今為止，已經從不同來源的細菌中分離并鑒定出甲硫氨酸腺苷轉移酶，如畢赤酵母、甲烷球菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱厭氧菌、大腸桿菌等。甲硫氨酸腺苷轉移酶雖然廣泛存在于動物、植物和微生物，但天然表達的甲硫氨酸腺苷轉移酶含量少，分離純化困難，因而限制了酶催化法的大規模使用。因此，構建高效表達甲硫氨酸腺苷轉移酶工程菌成為用酶催化法制備S-腺苷-L-甲硫氨酸的首要任務。與此同時，S-腺苷-L-甲硫氨酸是一種含有兩個手性中心的化合物，具有(R,S)-SAM和(S,S)-SAM兩種異構體，但僅有(S,S)-SAM具有生物活性。盡管如此，并沒有報道能夠通過酶催化法獲得較純的產物(S,S)-SAM的方法。

氟化天然產物因其具有獨特的物理和化學性質而受到生物學家和化學家的持續關注。氟化酶(FLA)作為一種已發現的酶，其能夠將無機氟離子(F^-)催化到有機分子中形成碳-氟(C-F)鍵，生成有機氟化物。在2002年，英國David?O’Hagan教授的研究小組從卡特利亞鏈霉菌(Streptomyces?cattleya)中分離出第一個天然氟化酶(由flA基因編碼)。它能夠利用無機氟離子和S-腺苷-L-甲硫氨酸催化S_N2生物親核反應，生成5’-氟化脫氧腺苷(5’-FDA)和L-甲硫氨酸。隨著對氟化酶及其代謝通路的研究，從2014年到2016年，在不同菌種中確定了四個新的氟化酶。其中，在星海鏈霉菌(Streptomyces?xinghaiensis)中發現的氟化酶具有最優的酶學性質。因此以甲硫氨酸腺苷轉移酶化生成的產物S-腺苷-L-甲硫氨酸作為氟化酶催化的反應底物，構建一個雙酶級聯反應，更有益于人們對鏈霉菌中氟化通路的理解以及衍生對氟化天然產物的應用。

發明內容