[發明專利]一種高立體選擇性的甲硫氨酸腺苷轉移酶及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 202110163535.0
• 申請日: 2021-02-05
• 公開（公告）號: CN112760303B
• 公開（公告）日: 2023-06-20
• 發明（設計）人: 馬龍;任思羽;程新寬;滿淑麗
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12P13/12;C12P19/40
• 代理公司: 蘇州達權專利代理事務所(普通合伙) 32737
• 代理人: 溫明霞

1.一種高立體選擇性的甲硫氨酸腺苷轉移酶在酶催化法中生產S-腺苷-L-甲硫氨酸及與氟化酶的雙酶級聯反應中的應用，其特征在于，所述轉移酶為一種Co²⁺依賴型的酶，其DNA序列如SEQ?ID?NO?.1所示，所述轉移酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO?.2所示，所述轉移酶由星海鏈霉菌中提取的甲硫氨酸腺苷轉移酶的基因序列metK與表達載體pET-32a(+)進行雙酶切后連接得到；

所述轉移酶的制備方法具體步驟如下：

1)提取星海鏈霉菌的基因組；

2)以步驟1)中的基因組為DNA模板，采用PCR擴增技術，得到星海鏈霉菌中的甲硫氨酸腺苷轉移酶的基因序列即metK目的片段；

3)將步驟2)中的metK目的片段與表達載體pET-32a(+)進行雙酶切后連接，構建重組質粒，所述雙酶切的位點分別為NdeI和XhoI；

4)采用熱激化法將步驟3)中的重組質粒轉化到大腸桿菌BL21的感受態細胞中，并經過異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導表達，得到高立體選擇性的甲硫氨酸腺苷轉移酶即SxMAT；

5)通過對步驟4)中的高立體選擇性的甲硫氨酸腺苷轉移酶的包涵體部分進行變性后復性的方式，得到高純度的高立體選擇性的甲硫氨酸腺苷轉移酶；

所述轉移酶的最適反應溫度為55℃，最適反應pH值為8.5，且所述轉移酶催化的產物的光學純度(ee)90％，產率為80％，所述轉移酶的熱穩定性范圍為25-55℃，pH穩定范圍為8-10.5，反應液中添加金屬離子Co²⁺能提高轉移酶活性；

所述轉移酶與氟化酶聯用，構建體外雙酶級聯反應，直接催化底物無機氟離子和ATP以及L-Met，生成5’-氟化脫氧腺苷。