[發明專利]一種間充質干細胞體外抑制Th1、Th17的檢測方法

在審

• 申請號: 202110161471.0
• 申請日: 2021-02-05
• 公開（公告）號: CN112725274A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 朱灝
• 申請（專利權）人: 華夏源（上海）生命科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12Q1/02
• 代理公司: 上海微策知識產權代理事務所(普通合伙) 31333
• 代理人: 張靜

本發明涉及干細胞生物學技術領域，更具體涉及一種間充質干細胞體外抑制Th1、Th17的檢測方法。包括：步驟一：間充質干細胞和外周血單個核細胞共培養；步驟二：固定破膜染色和檢測。本發明提供一種檢測方法，通過使用間充質干細胞和外周單個核細胞共培養，促進淋巴細胞增殖分化，從而促進間充質干細胞抑制作用的體現，提高抑制效果；對共培養得到的PBMC細胞進行刺激阻斷，從而促進因子分泌，同時加入抑制及將因子阻斷，來進行檢測，從而進一步促進PBMC細胞中Th1和Th17的表達，提高檢測得到的Th1和Th17的表達，提高進一步體現抑制效果。

技術領域

本發明涉及干細胞生物學技術領域，更具體地，本發明涉及一種間充質干細胞體外抑制Th1、Th17的檢測方法。

背景技術

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類多能干細胞，來源于發育早期的中胚層和外胚層，可以在骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉和臍帶等多種組織中分離，具有向成骨細胞、成軟骨細胞、成脂肪細胞、骨髓基質、神經細胞、肝臟細胞、胰島細胞和心肌細胞等多向分化的潛能。具有來源方便，易于分離、培養、擴增和純化，多次傳代擴增后仍具有干細胞特性，不存在免疫排斥的特性。

間充質干細胞不僅能促進損傷組織的再生與修復，還擁有良好的免疫調節能力，此外還可以作為基因治療的載體。制備間充質干細胞的方法種類繁多，例如組織塊貼壁培養法、臍帶勻漿膠原酶消化法與改良膠原酶消化法等，但是目前的研究大多著眼于間充質干細胞的臨床治療應用，并不存在一個良好的評價機制來鑒定諸多制備方法制備得到的間充質干細胞免疫調節能力的好壞。

CN201811507077.2提供間充質干細胞免疫調節能力的檢測方法，將原始樣本與待評價的間充質干細胞進行共培養，通過檢測淋巴細胞亞群的比例變化量，來評價間充質干細胞的抑制作用，從而對間充質干細胞的免疫調節能力進行評價，但是在間充質干細胞體外抑制T淋巴細胞亞群Th1和Th17檢測中，存在抑制率低、效果不明顯、重復性差等特點。

發明內容

為了解決上述問題，本發明第一個方面提供了一種間充質干細胞體外抑制Th1、Th17的檢測方法，包括：

步驟一：間充質干細胞和外周血單個核細胞共培養；

步驟二：固定破膜染色和檢測。

作為本發明一種優選的技術方案，所述步驟一包括：將間充干細胞和外周血單個核細胞混合，加入抗體培養后，離心，加入含有刺激劑的培養基刺激細胞后，加入抑制劑培養、離心，得到的細胞沉淀洗滌后，用平衡鹽溶液重懸，得到重懸溶液。

作為本發明一種優選的技術方案，所述步驟一中，間充質干細胞和外周血單個核細胞的細胞數比為1：(5～15)。

作為本發明一種優選的技術方案，所述抗體包括anti-CD3和anti-CD28。

作為本發明一種優選的技術方案，所述anti-CD3的濃度為3～7μg/mL，所述anti-CD28的濃度為3～7μg/mL。

作為本發明一種優選的技術方案，所述刺激劑包括PMA和Ionomycin。

作為本發明一種優選的技術方案，所述含有刺激劑的培養基中，PMA的濃度為40～60ng/mL，Ionomycin的濃度為0.8～1.5μg/mL。

作為本發明一種優選的技術方案，所述步驟二包括：將步驟一得到的重懸溶液中細胞用固定劑、破膜劑和染色抗體處理后，孵育、洗滌，去除上清液后，加入重懸溶液檢測。

作為本發明一種優選的技術方案，所述步驟二包括：

將步驟一得到的重懸溶液細胞依次用固定劑、破膜劑和染色抗體處理后，孵育、洗滌，去除上清液后，加入重懸溶液檢測。

本發明第二個方面提供了一種所述的