[發明專利]一種多重核酸擴增產物檢測方法及試劑盒

在審

• 申請號: 202110160212.6
• 申請日: 2021-02-05
• 公開（公告）號: CN112852928A
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 何清聰;周侗;王晶;劉仁源;陳立勇;任青云
• 申請（專利權）人: 廣東東陽光藥業有限公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/70;C12Q1/689;C12R1/93
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本發明屬于酸檢測技術領域，公開一種多重核酸擴增產物檢測方法，包括：建立包含顯示劑的擴增反應體系，所述擴增反應體系中還包含待測樣本、引物和擴增試劑；然后通過顯色染料法判讀擴增反應體系擴增結果；再根據判讀的擴增結果判斷是否進行試紙條檢測。該方法將顯色染料檢測法與試紙條檢測相結合，通過在多重核酸擴增體系中加入顯色劑和不同的修飾引物，先利用顯色劑的顯色反應實現可視化判讀核酸擴增結果，判斷待測液是否成功擴增，擴增成功的待測液再通過免疫層析試紙條實現目標核酸的檢測。由此可以剔除陽性樣本中的假陽性樣本，從而降低假陽率，提高檢測的準確度，同時試紙條的檢測線可全部用于檢測指標，保證了擴增體系的多重檢測能力。

技術領域

本發明涉及核酸檢測技術領域，具體涉及一種多重核酸擴增產物檢測方法及試劑盒。

背景技術

病原體感染導致的傳染性疾病的診斷往往需要結合病原學檢查進行確診，而對于傳染性高或致死率高的病原體(如新型冠狀病毒(SARS-COV-2))的檢測，以及復雜病情(疑似多重感染)的病原體檢測，往往需要用到多靶標聯檢。

在中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所發布的新型冠狀病毒核酸檢測引物和探針序列中，說明新冠病毒檢測試劑盒的目標序列分別為開放讀碼框1ab(open readingframe，ORF1ab)、核殼蛋白(nucleoprotein，N)基因區域；同時檢測需以人的基因作為內參，用于監控樣本采集和提取效果，避免假陰性結果。而采用單靶標檢測技術對某份待檢樣品中的多種可疑靶標進行檢測，需要對一份樣品進行反復的操作，不但大幅增加了工作量，延長了檢測周期，增加了失誤概率，同時可能帶來樣品污染及樣品生物危害等，而且對檢測結果可靠性、檢測人員/環境生物安全均帶來問題。因此基于檢測性能(敏感性、特異性、樣品耐受性)與操作性能(簡便、快速)等多個方面的因素，需要對一份樣本中存在的多個靶標進行同步檢測，即多重檢測。多重擴增在單個反應管中同時進行多個反應，既保留了傳統擴增的相對高的靈敏度，又能一次性擴增多個靶基因，可節省大量的時間和試劑成本，操作簡單，具有巨大的時效性和經濟性。

目前市場上多靶標病原體核酸檢測主要是利用多重PCR實現擴增，對應的PCR探針法、多重擴增-雜交、多重擴增-毛細管電泳、多重擴增-質譜等檢測技術只適用于大醫院、疫控中心等大型醫療機構，因為設備成本高、操作環境和人員要求高等原因，很難用在基層現場快檢以及用于病原體流行的早期篩查。

發明內容

本發明的目的在于提供一種多重核酸擴增產物檢測方法，該方法將顯色染料檢測法與試紙條檢測相結合，通過在多重核酸擴增體系中加入顯色劑和不同的修飾引物，先利用顯色劑的顯色反應實現可視化判讀核酸擴增結果，之后再利用核酸試紙條實現特定核酸產物的檢測，有效提高檢測效率和檢測準確度。

本發明的另一目的在于提供一種多重核酸擴增產物檢測試劑盒，有效提高檢測效率和檢測準確度。

具體地，本發明采用以下技術方案：

第一方面，本發明提供一種多重核酸擴增產物檢測方法，包括：建立包含顯示劑的擴增反應體系，所述擴增反應體系中還包含待測樣本、引物和擴增液；然后通過顯色染料法判讀擴增反應體系擴增結果；再根據判讀的擴增結果判斷是否進行試紙條檢測。

根據本發明提供的一些實施方式，所述多重核酸擴增產物檢測方法包括步驟：

S1：建立擴增反應體系：提供待測樣本，所述待測樣本含有內參核酸；提供引物，所述引物包括內參引物和目標核酸修飾引物，將待測樣本、內參引物、目標核酸修飾引物、顯色劑和擴增液混合形成混合液，進行擴增反應，得到待測液；

S2：顯色染料法判讀擴增結果：觀察待測液中顯色劑的顯色反應，如未發生顯色變化，停止檢測，如發生顯色變化，進行下一步；

S3：試紙條檢測：將待測液轉移至試紙條進行檢測。