[發明專利]基于固態納米孔傳感器的miRNA檢測方法、檢測探針及試劑盒

在審

• 申請號: 202110159160.0
• 申請日: 2021-02-05
• 公開（公告）號: CN112795628A
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發明（設計）人: 翁麗星;武靈芝;嚴馨;曾祥杰
• 申請（專利權）人: 南京郵電大學
• 主分類號: C12Q1/6825
• 分類號: C12Q1/6825;C12N15/11
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 柏尚春

本發明公開了一種基于固態納米孔傳感器的miRNA檢測方法、檢測探針及試劑盒。本發明的檢測方法包括以金納米顆粒作為載體，對不同金納米顆粒進行DNA探針單分子標記。當探針與靶miRNA共存時，DNA探針與miRNA目標靶分子雜交互補，誘導探針形成金納米顆粒二聚體。當金納米顆粒單體和二聚體通過納米孔傳感器時產生不同的電流軌跡特征信號，從而識別出miRNA目標靶分子。本發明可同時對多種肺癌標志物miRNA生物靶分子的多元檢測。本發明解決了固態納米孔傳感器難以對miRNA小生物分子檢測的難題，同時實現了對多種肺癌標志物miRNA靶分子的多元聯合檢測，擴展了氮化硅固態納米孔在單分子檢測領域的應用。

技術領域

本發明涉及一種固態納米孔傳感器檢測方法，特別涉及一種基于固態納米孔傳感器的miRNA檢測方法、檢測探針及試劑盒。

背景技術

miRNA是非蛋白編碼的短RNAs，可在轉錄或轉錄后水平調節mRNA的表達。大量研究表明，miRNA在細胞增殖、分化、凋亡和代謝方面發揮著重要作用。在多種人類惡性腫瘤中已經檢測到異常表達的miRNA，并且與腫瘤的發生、發展、預測、診斷、治療和術后有關，因此，miRNA作為癌癥診斷、預測和治療的潛在標記物，具有廣闊的臨床應用前景。miRNA在非小細胞肺癌中扮演著多重角色，包括在肺癌發生過程中發揮促癌基因或抑癌基因的作用，調控肺癌細胞的增殖和分化，參與肺癌的侵襲和轉移，影響肺癌對放、化療的敏感性等。目前，對肺癌的早期診斷存在困難，其被發現時2/3已為晚期。因此，如何提高肺癌早期診斷率已成為改善患者預后的重要課題。作為一種非侵入性診斷方法，miRNA的出現和應用為早期診斷肺癌提供了準確可靠的支持。同時研究表明，聯合多種miRNA靶分子，可以提高在診斷肺癌時的靈敏度和特異度，所以實現對多種miRNA目標分子的高靈敏多元檢測尤為重要。

由于miRNAs的核糖核苷酸序列較短，在細胞內含量低，且同源性較高，使得miRNAs的高靈敏檢測面臨挑戰。迄今為止，已報道有多種檢測miRNAs的方法和技術，主要有Northern Blotting，微陣列芯片法，核酸擴增等，但難以滿足miRNAs的特異性高通量檢測需求。納米孔傳感器作為一種單分子檢測工具，具有無標記、高特異性和靈敏高效等特征，在DNA和蛋白質等生物分子檢測上具有潛在的優勢。有關生物納米孔對DNA以及RNA等生物小分子的檢測研究已經取得一定的進展。生物納米孔具有較小的孔徑，一般1-2nm左右，允許單鏈核酸分子通過，通過miRNAs雜交和雙鏈解鏈反應，生物納米孔對其具有較高的分辨率。但miRNAs在固態納米孔中的檢測還面臨困難，因加工工藝以及膜厚度等因素，固態納米孔電信號的背景噪音較大，對短的DNA序列等小分子分辨率較低。同時，短的DNA序列在通過固態納米孔時，速度過快，信號采集也有較高的要求。對此人們對固態納米孔芯片進行一系列改進，比如表面修飾等，但修飾后的納米孔成本高，且檢測分子單一，不利于高通量的檢測。因此，為了進一步擴大固態納米孔的應用，利用固態納米孔傳感器良好的單分子高分辨特性，探索一個miRNA等小分子的高效多元檢測平臺，實現對多種癌癥標志物的多元檢測，具有十分重要的臨床醫學研究價值。

發明內容

發明目的：本發明提供了一種基于固態納米孔傳感器的miRNA檢測方法、檢測探針及試劑盒。本發明基于DNA探針修飾的金納米顆粒載體，利用納米孔傳感器進行miRNA檢測。

技術方案：本發明一種基于固態納米孔傳感器的miRNA檢測方法，包括以下步驟：

(1)使用BSPP修飾金納米顆粒(將BSPP(二水合雙(對-磺酸苯基)磷化二鉀鹽)加入金納米顆粒溶液，在室溫下振蕩過夜，將氯化鈉緩慢加入到混合物中，同時攪拌，直至顏色從深酒紅變成淺紫色)；

(2)將金納米顆粒與DNA探針孵育，室溫下輕輕搖動，得到檢測探針；所述檢測探針至少包括第一檢測探針以及第二檢測探針；所述第一檢測探針的DNA探針包括用于識別第一目標分子上游片段的第一捕獲鏈，所述第二檢測探針的DNA探針包括用于識別第一目標分子下游片段的第二捕獲鏈；

(3)在混合物中加入磷酸鈉緩沖液，該混合物在室溫下孵育；