[發明專利]一種混合精斑提取工藝

有效

• 申請號: 202110158205.2
• 申請日: 2021-02-04
• 公開（公告）號: CN112725332B
• 公開（公告）日: 2023-08-22
• 發明（設計）人: 羅深恒;杜舟;王傳海;李湘琴;于瑞國;尹路;曲冬陽;王偉妮;張博;彭珊;朱冬明
• 申請（專利權）人: 廣州高盛智造科技有限公司;深圳市公安局刑事警察支隊
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

1.一種混合精斑提取工藝，其特征在于，所述混合精斑提取工藝包括：

對檢材進行一次裂解，收集一次沉淀，對一次沉淀進行二次裂解，收集二次沉淀，對二次沉淀進行三次裂解，收集上清液，獲得含有男性DNA的溶液；

所述混合精斑提取工藝包括以下步驟：

(1)將檢材與包括Tris-Cl、氯化鈉和十二烷基硫酸鈉的裂解液于50～60℃混合20～40min，離心，收集沉淀；

(2)將步驟(1)得到的沉淀與清洗液混合，離心，收集沉淀；

(3)將步驟(2)得到的沉淀與包括Tris-Cl、氯化鈉、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸鈉、Triton-X?100、脫氧膽酸鈉、氯化鎂和氯化鈣的裂解液于50～60℃混合20～40min，離心，收集沉淀；

(4)將步驟(3)得到的沉淀與清洗液混合，離心，收集沉淀；

(5)將步驟(4)得到的沉淀與包括Tris-Cl、氯化鈉、十二烷基硫酸鈉、鹽酸胍、二硫蘇糖醇和檸檬酸鈉的裂解液混合，離心，收集上清液，獲得含有男性DNA的溶液；

步驟(1)所述Tris-Cl在所述裂解液中的濃度為90～110mM，所述氯化鈉在所述裂解液中的濃度為9～11mM，所述十二烷基硫酸鈉在所述裂解液中的質量百分比為1％～3％；

步驟(3)所述Tris-Cl在所述裂解液中的濃度為90～110mM，所述氯化鈉在所述裂解液中的濃度為18～22mM，所述乙二胺四乙酸在所述裂解液中的濃度為9～11mM，所述十二烷基硫酸鈉在所述裂解液中的質量百分比為0.5％～1.5％，所述Triton-X?100在所述裂解液中的質量百分比為0.25％～0.75％，所述脫氧膽酸鈉在所述裂解液中的質量百分比為0.25％～0.75％，步驟(3)所述氯化鎂在所述裂解液中的濃度為18～22mM，所述氯化鈣在所述裂解液中的濃度為9～11mM；

步驟(5)所述Tris-Cl在所述裂解液中的濃度為90～110mM，所述氯化鈉在所述裂解液中的濃度為90～110mM，所述十二烷基硫酸鈉在所述裂解液中的質量百分比為0.5％～1.5％，所述鹽酸胍在所述裂解液中的濃度為2～6mM，所述二硫蘇糖醇在所述裂解液中的濃度為3～7mM，所述檸檬酸鈉在所述裂解液中的濃度為45～55mM；

所述清洗的清洗液包括Tris-Cl、氯化鈉和乙二胺四乙酸，所述Tris-Cl在所述清洗液中的濃度為90～110mM，所述氯化鈉在所述清洗液中的濃度為18～22mM，所述乙二胺四乙酸在所述清洗液中的濃度為9～11mM。

2.根據權利要求1所述的混合精斑提取工藝，其特征在于，所述混合精斑提取工藝在全自動移液工作站中進行。

3.根據權利要求1所述的混合精斑提取工藝，其特征在于步驟(5)所述混合的溫度為50～60℃，所述混合的時間為20～40min。

4.根據權利要求1所述的混合精斑提取工藝，其特征在于，所述混合精斑提取工藝還包括純化DNA的步驟。

5.根據權利要求4所述的混合精斑提取工藝，其特征在于，所述純化包括使用磁珠吸附DNA，并進行清洗和洗脫，得到純化的DNA。

6.根據權利要求5所述的混合精斑提取工藝，其特征在于，所述吸附的結合液包括異丙醇。

7.根據權利要求6所述的混合精斑提取工藝，其特征在于，所述異丙醇的體積分數為80％～90％。

8.根據權利要求5所述的混合精斑提取工藝，其特征在于，所述洗脫的洗脫液包括Tris-Cl、氯化鈉和乙二胺四乙酸。

9.根據權利要求1-8任一項所述的混合精斑提取工藝，其特征在于，所述混合精斑提取工藝包括以下步驟：

(1)在全自動移液工作站中，移液泵將包括Tris-Cl?90～110mM、氯化鈉9～11mM和十二烷基硫酸鈉1％～3％的裂解液加入到檢材中混合，50～60℃孵育20～40min，機械夾手將混合液移至離心機進行離心，收集沉淀；

(2)移液泵將步驟(1)得到沉淀與包括Tris-Cl?90～110mM、氯化鈉18～22mM和乙二胺四乙酸9～11mM的清洗液混合，機械夾手將混合液移至離心機進行離心，收集沉淀；

(3)移液泵將步驟(2)得到沉淀與包括Tris-Cl?90～110mM、氯化鈉18～22mM、乙二胺四乙酸9～11mM、十二烷基硫酸鈉0.5％～1.5％、Triton-X?1000.25％～0.75％、脫氧膽酸鈉0.25％～0.75％、氯化鎂18～22mM和氯化鈣9～11mM的裂解液混合，50～60℃孵育20～40min，機械夾手將混合液移至離心機進行離心，收集沉淀；

(4)移液泵將步驟(3)得到沉淀與包括Tris-Cl?90～110mM、氯化鈉18～22mM和乙二胺四乙酸9～11mM的清洗液混合，機械夾手將混合液移至離心機進行離心，收集沉淀；

(5)移液泵將步驟(4)得到沉淀與包括Tris-Cl?90～110mM、氯化鈉90～110mM、十二烷基硫酸鈉0.5％～1.5％、鹽酸胍2～6mM、二硫蘇糖醇3～7mM和檸檬酸鈉45～55mM的裂解液混合，50～60℃孵育20～40min，機械夾手將混合液移至離心機進行離心，收集上清液，獲得含有男性DNA的溶液；

(6)移液泵將步驟(5)得到的含有男性DNA的溶液和體積分數為80％～90％的異丙醇溶液轉移至結合板，機械夾手將結合板轉移至磁吸板位進行磁珠吸附，隨后移液泵將結合板中的溶液吸出并棄掉；

(7)移液泵將包括Tris-Cl、NaCl、鹽酸胍、異丙醇和乙醇的清洗液加入步驟(6)吸附后的結合板中進行清洗，隨后進行磁珠吸附并棄掉清洗液；

(8)移液泵將乙醇加入步驟(7)吸附后的結合板中進行清洗，隨后進行磁珠吸附并棄掉清洗液；

(9)移液泵將包括Tris-Cl、氯化鈉和乙二胺四乙酸的洗脫液加入步驟(8)吸附后的結合板中進行洗脫，收集洗脫液，得到純化的男性DNA。