[發(fā)明專(zhuān)利]一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)生物小分子標(biāo)志物的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110156680.6
• 申請(qǐng)日: 2021-02-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112730706A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賈偉;袁角建;高江國(guó);林景超
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 麥特繪譜生物科技（上海）有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N30/06
• 分類(lèi)號(hào): G01N30/06;G01N30/88
• 代理公司: 上海浙晟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31345
• 代理人: 楊小雙

1.一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)生物小分子標(biāo)志物的方法，其特征在于，包括下列步驟：

步驟S1：標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

(a)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)標(biāo)液的配制

分別稱(chēng)取氧化三甲胺，膽堿、肌酐、甜菜堿和左旋肉堿內(nèi)標(biāo)適量，用50％乙腈水溶液溶解，配制各內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，再用50％乙腈水溶液稀釋配制1-10μM的混合內(nèi)標(biāo)工作溶液；

(b)標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

分別稱(chēng)取氧化三甲胺、膽堿、甜菜堿、肌酐、左旋肉堿、和咪唑丙酸適量，用50％乙腈水溶液溶解，配制單標(biāo)標(biāo)品儲(chǔ)備溶液，其中三甲胺為已知濃度的儲(chǔ)備溶液，再使用50％乙腈水溶液配制上述7種物質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液；

使用50％乙腈水溶液稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，使其濃度范圍分別為：TMA 0.098-25.0μg/mL，TMAO 0.019-12.5μM，Choline 0.019-12.5μM，Betaine 0.039-12.5μM，Creatinine 0.019-12.5μM，L-Carnitine 0.039-12.5μM，Imidazolepropionic acid0.0195-1.5625μM；

(c)質(zhì)控品的配制

分別稱(chēng)取氧化三甲胺、膽堿、甜菜堿、肌酐、左旋肉堿、和咪唑丙酸適量，用50％乙腈水溶液溶解，配制得到質(zhì)控品儲(chǔ)備溶液，其中三甲胺為已知濃度液體儲(chǔ)備液，用50％乙腈水溶液稀釋質(zhì)控儲(chǔ)備溶液，分別配制得到低濃度、中濃度和高濃度三個(gè)濃度水平的質(zhì)控工作溶液；

取20-30份生物樣本等量體積混合，制得混合QC，用移液槍移取20μLQC樣本，加入不超過(guò)總體積10％的混合質(zhì)控工作溶液，制得低濃度質(zhì)控品(LQC)、中濃度質(zhì)控品(MQC)和高濃度質(zhì)控品(HQC)；每個(gè)濃度點(diǎn)平行制備3份，放-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

步驟S2：質(zhì)控樣本的前處理

質(zhì)控品從-80℃冰箱取出后在低溫操作臺(tái)上解凍，吸取5-10μL內(nèi)標(biāo)工作液加入其中，然后吸取一定量蛋白沉淀試劑加入，振蕩離心取上清液進(jìn)質(zhì)譜分析；

步驟S3：生物樣本的前處理

樣本在低溫環(huán)境解凍后，振蕩離心，用移液槍吸取10-30μL樣本于1.5mL離心管中，再吸取5-10μL的內(nèi)標(biāo)工作溶液加入其中，最后吸取50-100μL蛋白沉淀試劑加入其中，振蕩離心取上清液進(jìn)質(zhì)譜分析；

步驟S4：質(zhì)控品及待測(cè)樣本的檢測(cè)

使用超高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)步驟S2與步驟S3中處理得到的質(zhì)控品和待測(cè)樣本進(jìn)行檢測(cè)，用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算樣本濃度，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中各物質(zhì)的濃度為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液中各物質(zhì)的峰面積與對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，將待測(cè)物樣本中峰面積比值代入方程，計(jì)算得到樣本中各待測(cè)物濃度。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)生物小分子標(biāo)志物的方法，其特征在于，所述生物樣本包括人的血清、血漿和尿液。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)生物小分子標(biāo)志物的方法，其特征在于，所述內(nèi)標(biāo)為同位素內(nèi)標(biāo)，分別是氧化三甲胺-d9，膽堿-d9、肌酐-d3、甜菜堿-d11和左旋肉堿-d3。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)生物小分子標(biāo)志物的方法，其特征在于，使用蛋白質(zhì)沉淀劑作為內(nèi)標(biāo)工作液溶劑，蛋白沉淀劑使用純乙腈。