[發明專利]一株敲入Sic1基因的釀酒酵母基因工程菌及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202110156473.0
• 申請日: 2021-02-04
• 公開（公告）號: CN113322194B
• 公開（公告）日: 2023-08-25
• 發明（設計）人: 應漢杰;蔣穎;陳勇;趙偉;朱家慶;張濤;梁偲策;余斌
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12P7/06;C12R1/865
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 肖明芳

本發明公開了一株敲入Sic1基因的釀酒酵母基因工程菌，所述釀酒酵母由原始釀酒酵母利用CRISPR?Cas9技術敲入基因Sic1后改造而成。由于原始菌株在固定化發酵中菌體聚集過多且聚集體不成熟，電阻較高，阻礙了傳質傳導，導致其發酵周期的加長，而敲入Sic1基因的釀酒酵母基因工程菌對比原始釀酒酵母菌株在游離發酵中絮凝特性明顯減弱，在固定化發酵中細胞粘附聚集情況減少，黏附性降低，游離細胞增多，加強了傳質傳導，縮短了發酵周期。

技術領域

本發明屬于基因工程及微生物技術領域，具體涉及一株敲入Sic1基因的釀酒酵母基因工程菌及其構建方法和應用。

背景技術

生物膜也稱為生物被膜，是一種由微生物細胞和其分泌的胞外基質共同組成的生物聚集體，由微生物集群與其分泌出的多糖、蛋白、脂肪酸等形成膜狀結構附著于載體表面。生物膜的存在，不僅作為屏障為細胞的生命活動創造了穩定的內環境，介導了細胞與細胞、細胞與基質之間的連接，而且還承擔了物質轉運、信息的跨膜傳遞和能量轉換等功能，更重要的是，生物膜還作為一種重要的工業應用——固定化發酵。與游離細胞發酵相比，固定化發酵中所形成的生物膜能在發酵過程中表現出較高的底物耐受性和較快的發酵效率。通常條件下，常規的游離細胞發酵50g葡萄糖大約需要8h左右，而固定化細胞只需要6h就可以將糖轉化為乙醇，展現了固定化細胞出色的發酵效率和發酵能力。但生物膜過多，會造成菌體聚集過多且聚集體不成熟，電阻較高，阻礙了傳質傳導，導致其發酵周期的加長。

成簇規律間隔的短回文重復序列(Clustered?Regularly?Interspaced?ShortPalindromic?Repeats，即CRISPR)II型系統是細菌免疫系統，現已被改造用于基因工程。CRISPR-Cas9是繼ZFN、TALENs等基因編輯技術推出后的第三代基因編輯技術，短短幾年內，CRISPR-Cas9技術風靡全球，成為現有基因編輯和基因修飾里面效率最高、最簡便、成本最低、最容易上手的技術之一，成為當今最主流的基因編輯系統。

發明內容

發明目的：本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一株敲入Sic1基因的釀酒酵母基因工程菌。

本發明還要解決的技術問題是提供上述釀酒酵母基因工程菌的構建方法。

本發明最后要解決的技術問題是提供上述釀酒酵母基因工程菌的應用。

發明思路：釀酒酵母的周期素依賴性激酶抑制劑(cyclin-dependent?kinaseinhibitor,Cki)Sic1是酵母細胞周期的關鍵調控因子，控制細胞進入S期，協調細胞生長和增殖。因此，本發明選取Sic1基因作為改造對象，構建釀酒酵母基因工程菌，以定向減弱菌株絮凝性及減少固定化發酵中生物被膜量，進而提高發酵效率和發酵能力。

為了解決上述第一個技術問題，本發明公開了一株釀酒酵母基因工程菌，該菌株由向原始釀酒酵母敲入Sic1基因后改造得到，所述Sic1基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

其中，所述釀酒酵母為Saccharomyces?cerevisiae?1308，來源于中國工業微生物菌種保藏管理中心，菌株保藏編號：CICC?1308，可商購得到。

其中，所述Sic1基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

本發明利用CRISPR-Cas9系統進行基因改造。

為了解決上述第二個技術問題，本發明公開了上述釀酒酵母基因工程菌的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：