[發明專利]合成α-熊果苷的枯草芽孢桿菌及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 202110156063.6
• 申請日: 2021-02-04
• 公開（公告）號: CN112795526B
• 公開（公告）日: 2023-02-28
• 發明（設計）人: 劉龍;陳堅;呂雪芹;堵國成;李江華;劉延峰;周祺
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N9/10;C12N15/54;C12N15/75;C12P19/44;C12R1/125
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發明涉及一種合成α?熊果苷的枯草芽孢桿菌及其構建方法與應用，本發明提供了能穩定且高效生產α?熊果苷的基因工程菌株的構建方法，通過引入蔗糖磷酸化酶的優化的RBS^opt序列，并將蔗糖磷酸化酶的表達框整合至基因組上，顯著提高了α?熊果苷在胞外的積累量，最高濃度可達119.44g/L，底物HQ的摩爾轉化率為96.56％，為實現α?熊果苷的工業化生產奠定了基礎。本發明提供的重組枯草芽孢桿菌的構建方法簡便易行，菌株構建完成后生產性能穩定，具有很好的應用前景。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，尤其涉及一種合成α-熊果苷的枯草芽孢桿菌及其構建方法與應用。

背景技術

α-熊果苷(α-arbutin)的化學名為4-羥苯基-α-D吡喃葡萄糖苷，是目前國際上公認的安全有效的美白物質，由葡萄糖與氫醌通過α-糖苷鍵連接而成。由此可以看出，α-熊果苷的分子結構由兩部分功能團組成：親水性的葡萄糖殘基和能夠抑制黑色素合成酶活性的酚基。α-熊果苷與其異構體β-熊果苷相比，具有更優越的美白效果和更高的人體安全性；此外，α-熊果苷的穩定性更強，可以較為方便地添加至多種類型的美容用品中。因此，α-熊果苷具有廣闊的應用前景和市場，極具工業化價值。

α-熊果苷的合成可以通過化學合成法、植物提取法和生物轉化法這三類方法實現，其中，生物轉化法又可細分為酶催化法和全細胞催化法兩種。生物轉化法與前兩種方法相比，雖然具有反應溫和、操作簡便、綠色環保等突出的優勢，但普遍面臨著轉化率低、產量不穩定等問題。目前，應用于美容用品中的α-熊果苷主要是由日本的江琦格力高公司通過酶轉化的方法獲得；而國內對于α-熊果苷制備的研究較少，面對巨大的市場需求，亟待實現α-熊果苷的工業化生產。

目前被研究可用于催化合成α-熊果苷的酶主要有α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、蔗糖磷酸化酶、蔗糖異構酶、淀粉蔗糖酶、環糊精葡萄糖基轉移酶。這些酶利用不同的底物進行轉糖基化反應生產α-熊果苷，但不同酶的產物轉化能力各不相同。其中，蔗糖磷酸化酶(EC2.4.1.7)發生轉糖基化作用時，對于糖基供體底物有著嚴格的特異性要求：僅能以蔗糖、葡萄糖-1-磷酸、葡萄糖-1-氟化物作為底物；另一方面，蔗糖磷酸化酶對受體底物的特異性要求很低：糖、糖醇、酚類物質、羥基化合物及某些羧酸化合物均可作為受體底物。

在過去的研究中，為了大量獲得蔗糖磷酸化酶，研究人員往往采用高拷貝質粒游離表達目的基因。但由于高拷貝質粒在細胞內容易丟失，導致細胞的生產性能不穩定，難以實現工業化應用。而后，有研究嘗試將蔗糖磷酸化酶整合表達，以穩定細胞的生產性能。但α-熊果苷的產量及底物利用率仍有較大的提升空間。

發明內容

為了穩定且高效地生產α-熊果苷，我們對蔗糖磷酸化酶基因smut的RBS序列進行了優化，提高了枯草芽孢桿菌生產α-熊果苷的能力，具有重要的經濟價值和工業化意義。

本發明的第一個目的是提供一種合成α-熊果苷的枯草芽孢桿菌，其是在枯草芽孢桿菌宿主中整合表達蔗糖磷酸化酶，并采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的RBS調控蔗糖磷酸化酶基因表達。

進一步地，所述的蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

進一步地，所述的整合表達是在枯草芽孢桿菌宿主的yqhB位點、yitR位點和ymzB位點中的一個或多個位點整合包含蔗糖磷酸化酶基因的表達框。

進一步地，所述的枯草芽孢桿菌宿主為枯草芽孢桿菌WB800ΔnprB-ΔaprE-Δepr-Δbpr-ΔnprE-Δmpr-Δvpr-ΔwprA。是在WB800基礎上敲除中性蛋白酶nprE、堿性蛋白酶aprE、胞外蛋白酶epr、金屬蛋白酶mpr、桿菌肽酶bpr、中性蛋白酶nprB、細胞壁結合蛋白wprA及vpr基因。

本發明的第二個目的是提供所述的枯草芽孢桿菌的構建方法，包括如下步驟：