[發(fā)明專利]一種用于生產(chǎn)mcl-PHA的人工雙菌體系及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110152462.5
• 申請(qǐng)日: 2021-02-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112852891A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賈曉強(qiáng);劉亞茹;楊松源
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P7/62
• 分類號(hào): C12P7/62;C12P7/54;C12P7/64;C12P19/14;C12P19/02;C12N1/20;C12R1/19;C12R1/40
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 王麗

本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)mcl?PHA的人工雙菌體系及其應(yīng)用，人工雙菌體系由重組菌E.coliΔp?m?a?e與重組菌P.putida?acs組成。采用E.coliΔp?m?a?e利用木糖為底物分泌乙酸和胞外脂肪酸；采用P.putida?acs利用葡萄糖為主要生長(zhǎng)碳源，利用乙酸和FFA合成中長(zhǎng)鏈聚羥基脂肪酸酯。將底物利用與PHA合成等任務(wù)分配到不同菌株中執(zhí)行，雙菌形成了基于“營(yíng)養(yǎng)供給”和“解毒”的互利共生關(guān)系，提高了體系代謝功能，雙菌共培養(yǎng)得到mcl?PHA產(chǎn)量為0.541g/L，產(chǎn)量是單菌純培養(yǎng)的3.9倍，雙菌體系能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)復(fù)雜底物的利用，進(jìn)而降低底物成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)mcl-PHA的人工雙菌體系及其應(yīng)用，屬于微生物學(xué)混合菌群研究領(lǐng)域。

背景技術(shù)

聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate,PHA)是一種由微生物全合成的高分子聚酯，具有生物可降解性和生物相容性等多種高附加值特性。目前已商業(yè)化的PHA產(chǎn)品主要為短鏈聚羥基脂肪酸酯(short chain length polyhydroxyalkanoate，scl-PHA)，其高成本以及應(yīng)用范圍小限制了PHA的進(jìn)一步發(fā)展與應(yīng)用。mcl-PHA是一類單體碳原子數(shù)為6-14個(gè)的PHA，主要由熒光假單胞菌屬(fluorescent Pseudomonads)在非生長(zhǎng)平衡條件下合成。它們具有低結(jié)晶度、低玻璃化轉(zhuǎn)變溫度、低拉伸強(qiáng)度和高斷裂伸長(zhǎng)率，是一種彈性體聚合物。此外，相較于scl-PHA，mcl-PHA結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，更容易被改性后用于藥物遞送材料、皮膚掩膜和心臟瓣膜等新型生物醫(yī)學(xué)材料^[1]。因此，開(kāi)發(fā)合成mcl-PHA的工藝同時(shí)降低其生產(chǎn)成本有望解決目前PHA存在的問(wèn)題。

木質(zhì)纖維素來(lái)源的可發(fā)酵糖如葡萄糖和木糖等是一種廉價(jià)的可再生資源，利用其合成mcl-PHA與利用長(zhǎng)鏈脂肪酸為底物合成相比，能夠有效降低生產(chǎn)成本，但無(wú)法實(shí)現(xiàn)高效生產(chǎn)。目前，木質(zhì)纖維素已被應(yīng)用于PHA的合成，主要方式是通過(guò)各種方法將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖(葡萄糖和木糖)，進(jìn)而再用糖成分進(jìn)行生物發(fā)酵生產(chǎn)PHA。但大多數(shù)研究是合成PHB的研究，合成mcl-PHA則鮮有報(bào)道，Davis等人^[2]利用幾種不同的假單胞菌從不同方法處理的野生黑麥草水解物中合成mcl-PHA。盡管mcl-PHA的收率與糖混合物的收率相似，但最高收率為0.3g/L，難以滿足工業(yè)生產(chǎn)的需求。根據(jù)以前的研究報(bào)道，主要原因在于葡萄糖和木糖是PHA結(jié)構(gòu)不相關(guān)碳源，不同的碳源對(duì)于PHA的生物合成有很大的的影響。通常，碳源可分為“相關(guān)”碳源{與PHA單體相關(guān)的結(jié)構(gòu)，例如胞外脂肪酸(extracellular free fattyacids,FFA)}和“不相關(guān)”碳源(與PHA單體無(wú)關(guān)的結(jié)構(gòu)，例如木糖和葡萄糖)^[3]。

人工混菌共培養(yǎng)策略已成為代謝工程和合成生物學(xué)的新手段，被廣泛用來(lái)克服純培養(yǎng)過(guò)程的缺點(diǎn)^[4,5]。已有研究者將混菌體系應(yīng)用于PHA的合成，Shalin等^[6]通過(guò)構(gòu)建由Bacillus firmus NII 0830和Lactobacillus delbrueckii NII 0925組成的共培養(yǎng)體系實(shí)現(xiàn)PHB產(chǎn)量的提高。等^[7]利用藍(lán)藻和假單胞菌組成的人工雙菌體系將CO₂轉(zhuǎn)化為mcl-PHA，產(chǎn)量達(dá)到156mg/L。可見(jiàn)，混菌共培養(yǎng)策略已被廣泛應(yīng)用于PHA的合成。對(duì)于單菌純培養(yǎng)與天然混合菌群培養(yǎng)，單菌代謝能力是限制mcl-PHA產(chǎn)量的主要原因，且無(wú)法高效利用復(fù)雜底物，而自然形成或人工馴化的微生物混合菌群，普遍存在運(yùn)行周期長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化效率低、穩(wěn)定性及可控性差等問(wèn)題。因此，運(yùn)用合成生物學(xué)的方法和理論，構(gòu)建人工雙菌體系能夠?qū)崿F(xiàn)純培養(yǎng)微生物無(wú)法完成的任務(wù)或提高多細(xì)胞體系的代謝功能。目前為止，利用人工混菌體系以葡萄糖木糖混合碳源以及木質(zhì)纖維素水解液為底物合成mcl-PHA的研究未見(jiàn)報(bào)道。