[發(fā)明專利]一種用于生產(chǎn)mcl-PHA的人工雙菌體系及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110152462.5
• 申請(qǐng)日: 2021-02-03
• 公開（公告）號(hào): CN112852891A
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賈曉強(qiáng);劉亞茹;楊松源
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P7/62
• 分類號(hào): C12P7/62;C12P7/54;C12P7/64;C12P19/14;C12P19/02;C12N1/20;C12R1/19;C12R1/40
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 王麗

1.一種用于生產(chǎn)mcl-PHA的人工雙菌體系；其特征是，人工雙菌體系由重組菌E.coliΔp-m-a-e與重組菌P.putida-acs組成。

2.如權(quán)利要求1用于生產(chǎn)mcl-PHA的人工雙菌體系；其特征是，人工雙菌體系采用重組菌E.coliΔp-m-a-e利用木糖為底物分泌乙酸和胞外脂肪酸(FFA)；采用重組菌P.putida-acs利用葡萄糖為主要生長(zhǎng)碳源，利用乙酸和FFA合成中長(zhǎng)鏈聚羥基脂肪酸酯(mcl-PHA)。

3.權(quán)利要求1或2人工雙菌體系生產(chǎn)mcl-PHA的方法；其特征是，包括如下步驟：

(1)挑取重組菌株E.coliΔp-m-a-e和重組菌株P(guān).putida-acs的單菌落分別接種至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)以活化菌體；分別吸取兩種菌株的過夜培養(yǎng)物于M9液體培養(yǎng)基中，E.coliΔp-m-a-e培養(yǎng)以木糖為碳源，而P.putida-acs培養(yǎng)則以葡萄糖為碳源，分別獲得E.coliΔp-m-a-e和P.putida-acs的種子液；

(2)將步驟(1)獲得的重組菌株E.coliΔp-m-a-e接種至發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵；接種12-24h后，將P.putida-acs接種至發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵用于生產(chǎn)mcl-PHA；重組菌株E.coliΔp-m-a-e和重組菌株P(guān).putida-acs按照體積比0.5-2：1接種。

4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征是，步驟(2)的發(fā)酵培養(yǎng)基組分為(g/L)：Na₂HPO₄·7H₂O 12.8，KH₂PO₄ 3，NaCl 0.5，MgSO₄ 0.24，NH₄Cl，微量元素溶液1mL/L，pH 7.0±0.1；碳源為葡萄糖和木糖混糖，其中總糖濃度為20g/L，葡萄糖和木糖質(zhì)量比為1：1；氮源(氯化銨)濃度為1-4g/L。

5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征是，微量元素配方(g/L 1M HCl)：FeSO₄·7H₂O2.78，MnCl₂·4H₂O 1.98，CoCl₂·6H₂O 2.38，CaCl₂·2H₂O 1.47，CuCl₂·2H₂O 0.17，ZnSO₄·7H₂O 0.29。

6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征是，步驟(2)發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度30℃，經(jīng)過濾除菌的空氣以2vvm速率供給，通過自動(dòng)控制轉(zhuǎn)速將溶氧(DO)控制在25％以上；利用自動(dòng)添加0.5M H₂SO₄和1M KOH控制pH在7.0±0.1。

7.權(quán)利要求1人工雙菌體系應(yīng)用于纖維素水解液為含葡萄糖和木糖的混合溶液生產(chǎn)mcl-PHA。

8.權(quán)利要求1人工雙菌體系應(yīng)用玉米秸稈酶解為纖維素水解液生產(chǎn)mcl-PHA方法，其特征是，以經(jīng)氨水預(yù)處理的玉米秸稈為底物進(jìn)行酶解反應(yīng)，將粉末置于含有檸檬酸緩沖溶液進(jìn)行反應(yīng)，纖維素酶和半纖維素酶按2：1比例加入；利用高效液相色譜對(duì)水解液中糖成分進(jìn)行分析，水解液中糖成分主要為葡萄糖和木糖，二者比例為4.3：1。

9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征是，1M檸檬酸鈉緩沖液：750mL水中加入210g水合檸檬酸，加入NaOH 50-60g至pH＝4.3，定容至1L；此緩沖液稀釋至0.05M時(shí)pH＝4.8。