[發明專利]用于鏈霉素耐藥結核分枝桿菌的核酸快速檢測試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 202110150109.3
• 申請日: 2021-02-03
• 公開（公告）號: CN112725487A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 張國良;劉鵬;劉磊;王鑫杰;劉馨怡;董謙;張錦萍
• 申請（專利權）人: 張國良;劉鵬;劉磊;王鑫杰;劉馨怡;董謙;張錦萍;深圳國家感染性疾病臨床醫學研究中心;深圳市第三人民醫院;中國農業科學院深圳農業基因組研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/32
• 代理公司: 深圳市深弘廣聯知識產權代理事務所(普通合伙) 44449
• 代理人: 向用秀

本發明公開了一種用于鏈霉素耐藥結核分枝桿菌的核酸快速檢測試劑盒及其檢測方法，針對rpsl Wild type基因、rpsl K43R和rpsl K88R耐藥突變基因片段3個基因，設計一系列特異性crRNA,可靈敏、特異檢測到鏈霉素耐藥結核分枝桿菌核酸。本發明系首次采用Cas12a RR檢測鏈霉素耐藥結核分枝桿菌，具有靈敏度高、特異性強、耗時短、高通量、肉眼可直接判讀和不依賴大型實驗設備等優勢。這些優勢使得本發明開發的基于Cas12a RR熒光法方法方便用于臨床一線對鏈霉素耐藥結核分枝桿菌核酸的快速檢測和鑒定診斷。

技術領域

本發明涉及生物科技領域，尤其涉及一種用于鏈霉素耐藥結核分枝桿菌的核酸快速檢測試劑盒及其制備方法，更具體的說，涉及對鏈霉素耐藥結核分枝桿菌rpsl基因Lys43Arg和Lys88Arg突變位點核酸的快速診斷試劑盒及其檢測方法。

背景技術

結核病是由結核分枝桿菌引起的傳染病，主要是肺結核，也有其他器官結核(肺外結核)。目前全世界范圍內約有17億人感染了結核分枝桿菌，這些感染者在一定條件下(如免疫力下降、其它疾病侵襲時)都有發展為結核病的可能。而當這些活動性結核病患者通過咳嗽、噴嚏等方式將細菌排放到空氣中時，就會造成結核分枝桿菌的傳播。盡管人類早在一個多世紀前就發現了結核分枝桿菌(M ycobacterium tuberculosis，M.tb)，但是全世界每年仍然約有1000萬人新增結核病患者，其中中國2018年新增結核病約90萬例。根據2019年WHO全球結核統計報告統計，2018年全球約有150萬人因肺結核死亡，并且隨著結核治療藥物和抗生素的廣泛和不合理的使用，結核分枝桿菌耐藥越發嚴重，在2018年，大約有50萬結核患者發展為多重耐藥，約有25萬人死于多重耐藥結核分枝桿菌感染。其中鏈霉素(Streptomycin,STR)是治療結核病最經典一線藥物的組成部分，鏈霉素耐藥最常見的突變是rpsL基因的Lys43Arg和Lys88Arg替代，這兩個位點的耐藥突變率高達80-90％。并且鏈霉素耐藥占所有一線抗結核藥物耐藥的60％以上。此外，印度、中國和俄羅斯三國結核耐藥發病人數占全球45％。

這給結核病的防控帶來了巨大的壓力，也是結核病死亡率居高不下的主要原因之一，肺結核已經成為全球十大死亡原因之一，也是世界范圍內單一感染源(排在HIV/AIDS之上)的主要死亡原因。臨床研究發現，及時準確的診斷及規范化、足療程的治療，大多數結核病及耐藥結核病患者能治愈，從而減少了這種慢性傳染病的進一步傳播。目前卡介苗BCG作為預防結核感染唯一的疫苗，僅在兒童中有效，對成人肺結核不具備免疫保護效果。

目前耐藥結核病細菌學檢查方法主要是耐藥結核分枝桿菌藥敏試驗(drug sensitivity test，DST)、Xpert MTB/RIF、熒光定量PCR溶解曲線法和全基因組測序法(whole genome sequencing，WGS)。藥敏試驗仍是許多國家診斷耐藥肺結核的“金標準，”但由于其設備需求昂貴、污染率高，該類實驗耗費時間過長，不利于疾病的早期診斷和治療；此外，Xpert MTB/RIF、熒光定量PCR溶解曲線法需要特定的儀器，樣本要求高，敏感性一般，不報告具體的突變類型；全基因組測序法耗時長、儀器設備要求高、樣本要求高、費用較高，絕大部分地區未普及。這給臨床耐藥結核病的診斷帶來了很大的局限性，耐藥結核分枝桿菌低陽性檢出率給患者的早期診斷帶來了很大障礙，由于缺乏快速靈敏的檢測手段，很大一部分耐藥結核病患者未能得到及時正規救治，給疾病傳播的控制提供了很大的難度。診斷的延誤是耐藥結核病傳播和出現死亡的主要原因，切斷傳染源，且使耐藥結核病患者得到及時、規范化治療，可有效減輕致殘率及死亡率，因此早期、快速、靈感的檢測手段尤為重要。因此，耐藥結核病的早期診斷作為降低傳染率、改善預后的的必要條件，我們迫切需要找到更敏感、特異高且成本較低的耐藥結核病實驗室檢測手段，以期通過早發現、早診斷、進一步的規范化治療，改善患者的預后，減少這種慢性傳染病的傳播。