[發明專利]用于鏈霉素耐藥結核分枝桿菌的核酸快速檢測試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 202110150109.3
• 申請日: 2021-02-03
• 公開（公告）號: CN112725487A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 張國良;劉鵬;劉磊;王鑫杰;劉馨怡;董謙;張錦萍
• 申請（專利權）人: 張國良;劉鵬;劉磊;王鑫杰;劉馨怡;董謙;張錦萍;深圳國家感染性疾病臨床醫學研究中心;深圳市第三人民醫院;中國農業科學院深圳農業基因組研究所
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/32
• 代理公司: 深圳市深弘廣聯知識產權代理事務所(普通合伙) 44449
• 代理人: 向用秀

1.一種用于鏈霉素耐藥結核分枝桿菌的核酸快速檢測試劑盒，基于CRISPR/Cas12a RR的原理實現對結核病菌的快速檢測，其特征在于，包含特異性檢測rpsl K43R和rpsl K88R鏈霉素耐藥突變型DNA的Cas12a RR熒光檢測體系，檢測體系內包括有針對rpsl K43R和rpsl K88R鏈霉素耐藥突變型的特異性crRNA、Cas12a RR蛋白、rpsl基因的RPA擴增引物和ssDNA報告系統；

特異性crRNA為針對rpsl基因,序列為SEQ NO.1-25；

Cas12 RR蛋白為對Cas12a核酸序列進行原核密碼子優化，并對第532和595位氨基酸進行了突變，使其突變為G532R和K595R；

rpsl基因的RPA擴增引物為針對rpsl基因的rpsl-RPA-F4到rpsl-RPA-R2中的任意F和R組合，其序列為SEQ NO.33到SEQ NO.40。

ssDNA報告系統包含可用酶標儀熒光檢測或熒光燈下肉眼直接判讀的ssDNA FQreporter，即被6-羧基熒光素和熒光淬滅劑標記的ssDNA，標記產物如下：/5 6FAM/TTTATTT/3BHQ1/，命名為ssDNA FQ reporter/56FAM/TTTATTT/3BHQ1/。

2.根據權利要求1所述的用于鏈霉素耐藥結核分枝桿菌的核酸快速檢測試劑盒，其特征在于，特異性crRNA為覆蓋rpsl K43R和K88R突變位點且包含人為引入的錯配堿基的crRNA，針對rpsl的K43R和K88R突變位點的不同而命名為rpsl K43R-crRNA和rpsl K88R-crRNA。

3.根據權利要求1所述的用于鏈霉素耐藥結核分枝桿菌的核酸快速檢測試劑盒，其特征在于，Cas12 RR對除TTTN以外的TTCC、CTCC、TCCC序列堿基對進行有效識別和標記。

4.一種用于鏈霉素耐藥結核分枝桿菌的核酸快速檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于，用于權利要求1-3任一項所述的核酸快速檢測試劑盒，包括對crRNA的制備、Cas12a RR的制備以及對RPA擴增引物的制備：

crRNA制備方法如下：

S1:在rpsl基因的K43R、K88R位點附近尋找包含Cas12a RR識別序列TTCC、CTCC和TCCC的靶向序列；

S2:設計長度為23bp的覆蓋突變點且與突變型匹配的crRNA,并進行制備。

5.根據權利要求4所述的用于鏈霉素耐藥結核分枝桿菌的核酸快速檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于，Cas12a RR的制備步驟如下：

S1:針對Cas12a蛋白核酸序列進行原核密碼子優化并對第532和第595位氨基酸進行突變，使其變成為G532R和K595R，獲得序列SEQ NO.29,構建pET28a表達載體。

S2:進行低溫誘導可溶蛋白表達，通過親和純化和分子篩純化獲得目的蛋白。

6.根據權利要求4所述的用于鏈霉素耐藥結核分枝桿菌的核酸快速檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于，RPA擴增引物的制備方法包括以下步驟：

S1:針對鏈霉素耐藥結核分枝桿菌核酸rpsl基因，其序列為SEQ NO.33到SEQ NO.40，按照等溫擴增反應要求，設計包含rpsl-crRNA，長度為30-37bp的RPA擴增引物；

S2:設計完成后，合成RPA擴增引物。

7.根據權利要求4所述的用于鏈霉素耐藥結核分枝桿菌的核酸快速檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于，crRNA的制備通過構建載體pUC57-T7-crRNA，經體外轉錄獲得目的crRNA；或直接合成crRNA序列對應的RNA。