[發明專利]飛行時間質譜多重靶向DNA甲基化位點定量檢測方法

在審

• 申請號: 202110145666.6
• 申請日: 2021-02-02
• 公開（公告）號: CN112725425A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 張方舟;廉歡歡;張起起;秦勝紅;王新新;梁海泳
• 申請（專利權）人: 博淼生物科技（北京）有限公司
• 主分類號: C12Q1/6872
• 分類號: C12Q1/6872;C12Q1/6851
• 代理公司: 北京化育知識產權代理有限公司 11833
• 代理人: 涂琪順

本發明屬生物技術領域，具體公開了一種飛行時間質譜多重靶向DNA甲基化位點定量檢測方法，本發明提供了一種DNA甲基化位點的高通量檢測方法，可以針對多重待檢測的甲基化位點，設計特異性探針，在同一個反應體系中，得到定量甲基化程度檢測結果。具有操作簡單、可同時檢測在不同區域內的甲基化位點，降低對應的實驗成本等特點。

技術領域

本發明屬生物技術領域，具體公開了一種飛行時間質譜多重靶向DNA甲基化位點定量檢測方法。

技術背景

DNA的甲基化作為DNA—種重要的化學修飾，能在不改變DNA序列的前提下，影響DNA的遺傳表現。在脊椎動物中，絕大多數的DNA甲基化修飾為5甲基胞嘧啶(5mc)，在人類基因組中，大約有70％到80％的CpG二核苷酸參與了這種修飾DNA的甲基化可參與許多的生物學進程，包括基因組印記、轉座元件沉默、干細胞分化、胚胎發育等。DNA的甲基化作為一種重要的表觀遺傳現象，是表觀遺傳學的重要研究內容之一。

DNA甲基化檢測方法飛速發展，高通量測序技術、芯片技術進行全基因組甲基化檢測、定量的甲基化質譜檢測技術越來越多的技術應用于甲基化研究。隨著研究人員在甲基化領域的不斷研究，對甲基化位點的定量檢測需求也是越來越大。

目前現有的基于MassARRAY平臺的甲基化定量檢測技術，其原理是利用亞硫酸氫鈉在堿性條件和氫醌的催化下處理DNA，使非甲基化的胞嘧啶發生脫氨基反應從而轉變成尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶不能發生脫氨基反應，仍保留為胞嘧啶。第一輪擴增時，轉化后的U與A配對，在第二輪擴增中進一步轉變為T。最終使甲基化C與非甲基化C的區別，變成了C與T的區別。經過CT處理后的DNA樣本，經過PCR擴增，得到對應目的片段的擴增產物，對擴增產物進行SAP消化，然后用T7 RNADNA Polymerase和RNase A酶對產物同步進行逆轉錄和酶切，得到含有CpG site的小片段，而甲基化和非甲基化的片段分子量是不同的，通過時間飛行質譜即可區分片段并計算甲基化比例。該檢測方法的弊端在于無法在同一個反應well中同時檢測不在同一范圍內的CpG位點，并且因為技術的限制，并不能保證擴增片段中的CpG位點一定能檢出、或是單獨的檢測結果。

發明內容

針對上述問題，本發明提出一種飛行時間質譜多重靶向DNA甲基化位點定量檢測方法，可以基于MassARRAY核酸質譜平臺，實現同時針對多個不同位置的特定的CpG位點甲基化程度的檢測，并且可以得到待檢測CpG位點單獨的甲基化程度結果，減少實驗成本。

為達到上述目的，本發明的技術方案是這樣實現的：

一種飛行時間質譜多重靶向DNA甲基化位點定量檢測方法，包括如下步驟：

(1)針對特定位點設計特異性引物

(2)獲取DNA樣本

(3)對DNA進行亞硫酸氫鹽處理，將序列中非甲基化的C經過亞硫酸鹽處理后脫氨基變成U

(4)用步驟1中設計的引物擴增目的片段

(5)將步驟4中的產物經過SAP消化，去除未消耗的dNTP

(6)用ddNTP和UEP引物，對步驟5的產物進行單堿基延伸

(7)產物經脫鹽純化，進行飛行質譜檢測

(8)結果分析和判讀。

進一步的，上述一種飛行時間質譜多重靶向DNA甲基化位點定量檢測方法，所述檢測方法用于同時檢測多個不同區域內的CpG位點。

進一步的，上述一種飛行時間質譜多重靶向DNA甲基化位點定量檢測方法，所述步驟1中的特異性引物包括但不限于：針對待檢測的特定CpG位點所在的序列進行設計的特異性正向引物和反向引物或針對待檢測的特定CpG位點設計的單堿基延伸引物。