[發(fā)明專(zhuān)利]飛行時(shí)間質(zhì)譜多重靶向DNA甲基化位點(diǎn)定量檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110145666.6
• 申請(qǐng)日: 2021-02-02
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112725425A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張方舟;廉歡歡;張起起;秦勝紅;王新新;梁海泳
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 博淼生物科技（北京）有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6872
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6872;C12Q1/6851
• 代理公司: 北京化育知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11833
• 代理人: 涂琪順

1.飛行時(shí)間質(zhì)譜多重靶向DNA甲基化位點(diǎn)定量檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)針對(duì)特定位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物

(2)獲取DNA樣本

(3)對(duì)DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽處理，將序列中非甲基化的C經(jīng)過(guò)亞硫酸鹽處理后脫氨基變成U

(4)用步驟1中設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增目的片段

(5)將步驟4中的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)SAP消化，去除未消耗的dNTP

(6)用ddNTP和UEP引物，對(duì)步驟5的產(chǎn)物進(jìn)行單堿基延伸

(7)產(chǎn)物經(jīng)脫鹽純化，進(jìn)行飛行質(zhì)譜檢測(cè)

(8)結(jié)果分析和判讀。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的飛行時(shí)間質(zhì)譜多重靶向DNA甲基化位點(diǎn)定量檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)方法用于同時(shí)檢測(cè)多個(gè)不同區(qū)域內(nèi)的CpG位點(diǎn)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的飛行時(shí)間質(zhì)譜多重靶向DNA甲基化位點(diǎn)定量檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟1中的特異性引物包括但不限于：針對(duì)待檢測(cè)的特定CpG位點(diǎn)所在的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)的特異性正向引物和反向引物或針對(duì)待檢測(cè)的特定CpG位點(diǎn)設(shè)計(jì)的單堿基延伸引物。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的飛行時(shí)間質(zhì)譜多重靶向DNA甲基化位點(diǎn)定量檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟4具體包括使用特定CpG位點(diǎn)的上游引物-F和下游引物-R進(jìn)行第一輪PCR，對(duì)模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到含有特定CpG位點(diǎn)的片段。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的飛行時(shí)間質(zhì)譜多重靶向DNA甲基化位點(diǎn)定量檢測(cè)方法,其特征在于，所述步驟4中第一輪PCR的反應(yīng)條件如下：①預(yù)變性:95℃(5min)；②擴(kuò)增：95℃(20sec)，56℃(30sec)，72℃(1min)，共45個(gè)循環(huán)；③延伸：72℃(3min)，4℃(∞)。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的飛行時(shí)間質(zhì)譜多重靶向DNA甲基化位點(diǎn)定量檢測(cè)方法,其特征在于，所述步驟5中，對(duì)步驟4后得到的片段進(jìn)行去磷酸化處理，得到脫磷酸片段。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的飛行時(shí)間質(zhì)譜多重靶向DNA甲基化位點(diǎn)定量檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟5中去磷酸化的反應(yīng)條件如下：①去磷酸化:37℃(40min)；②SAP酶滅活：85℃(5min)，4℃(∞)。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的飛行時(shí)間質(zhì)譜多重靶向DNA甲基化位點(diǎn)定量檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟6具體包括用特定CpG位點(diǎn)的-UEP對(duì)步驟5后得到的脫磷酸片段進(jìn)行單堿基延伸，從而檢測(cè)出甲基化程度。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的飛行時(shí)間質(zhì)譜多重靶向DNA甲基化位點(diǎn)定量檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟6中單堿基延伸的反應(yīng)條件如下：①預(yù)變性:94℃(30sec)；②擴(kuò)增內(nèi)循環(huán):52℃(5sec)，80℃(5sec)，共5個(gè)循環(huán)；③擴(kuò)增外循環(huán):94℃(5sec)，52℃(5sec)，80℃(5sec)，共40個(gè)循環(huán)；④延伸：72℃(3min)，4℃(∞)。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的飛行時(shí)間質(zhì)譜多重靶向DNA甲基化位點(diǎn)定量檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟7具體包括如下步驟：

S1:在樹(shù)脂板上鋪好潔凈樹(shù)脂待用，每孔6mg樹(shù)脂，風(fēng)干分鐘；

S2:向樣本板的樣本空內(nèi)加入待測(cè)樣品，每個(gè)樣本孔再加ddH20，用封口膜密封，進(jìn)行瞬時(shí)離心；

S3:打開(kāi)覆蓋所述樣本孔的封口膜，將所述樣本板倒扣在所述樹(shù)脂板上固定，將固定好的樣本板和樹(shù)脂板整體翻轉(zhuǎn)，輕敲樹(shù)脂板，以使樹(shù)脂板中的樹(shù)脂完全落入樣本板上相應(yīng)樣本孔，用封口膜密封，進(jìn)行瞬時(shí)離心；

S4:將樣本樹(shù)脂混合物搖勾，在旋轉(zhuǎn)器上慢速旋轉(zhuǎn)15min后，在4000rpm條件下離心5min，離心后點(diǎn)樣上機(jī)、用質(zhì)譜儀對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。

11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的飛行時(shí)間質(zhì)譜多重靶向DNA甲基化位點(diǎn)定量檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟8中，對(duì)步驟7中得到的原始結(jié)果進(jìn)行解讀；根據(jù)產(chǎn)出的數(shù)據(jù)表格中的信噪比(SNR-1、SNR-2)，經(jīng)過(guò)計(jì)算，得到樣本甲基化位點(diǎn)的甲基化程度。計(jì)算公式為：SNR-C/(SNR-C+SNR-T)。