[發(fā)明專利]一種重組人白介素-6的制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110139577.0
• 申請(qǐng)日: 2021-02-01
• 公開（公告）號(hào): CN112679599A
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 任軍;王耀輝;賈凌云
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 大連理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/54
• 分類號(hào): C07K14/54;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;C12N15/24;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責(zé)任公司 21212
• 代理人: 周媛媛;李馨

1.一種重組人白介素-6的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)原核表達(dá)方式制備重組人白介素-6包涵體；

(2)采用含尿素的洗滌緩沖液A清洗重組人白介素-6包涵體，再用洗滌緩沖液B洗滌重組人白介素-6包涵體以除去尿素，離心收集固體，所得固體為初步純化后的重組人白介素-6包涵體；

(3)初步純化后的重組人白介素-6包涵體加入含有β-巰基乙醇的變性液中，至重組人白介素-6包涵體完全溶解，緩慢加入復(fù)性液使重組人白介素-6低溫靜置復(fù)性，再進(jìn)行透析和超濾濃縮，得到復(fù)性的重組人白介素-6；

(4)使用填充Anti-IL-6高親和吸附介質(zhì)的親和吸附柱對(duì)復(fù)性的重組人白介素-6進(jìn)行親和純化，得到重組人白介素-6。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中原核表達(dá)方式制備重組人白介素-6包涵體的具體方法包括如下步驟：將重組人白介素-6序列導(dǎo)入pET-21a或pET-24a表達(dá)載體中制成重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21或E.coli ShuffleT7中，擴(kuò)大表達(dá)，收集高效表達(dá)重組人白介素-6的菌體用IPTG誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)，收集菌體并將菌體破碎至菌液相對(duì)透明、不再粘稠，收集沉淀即為重組人白介素-6包涵體。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中的洗滌緩沖液A為10-50mMTris-HCl，1-4M尿素，80-200mM NaCl，pH＝8-9；洗滌緩沖液B為10-50mM Tris-HCl，pH＝8-9。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述含有β-巰基乙醇的變性液為6-8M鹽酸胍，100-200mM NaCl，1-1.5‰β-巰基乙醇的混合溶液或濃度大于8M的尿素，100-200mM NaCl，10-15mM DTT的混合溶液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述復(fù)性液為0.5-1.5M鹽酸胍，50-150mM Tris-HCl，8-12mM EDTA，0.25-0.5mM GSSG(氧化型)，2.5-5mM GSH(還原型)，300-700mM精氨酸，2-5％甘油，pH＝8-9；加入復(fù)性液的速度為0.1-0.5mL/min；4-6℃靜置20-40h。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中透析所用透析外液為10-50mM Tris溶液。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)中親和純化的方法為：將步驟(3)所得復(fù)性的重組人白介素-6溶液以0.2-1mL/min流過以高親和力Anti-IL-6抗體為親和配基，CL-6B瓊脂糖凝膠微球?yàn)楣梯d介質(zhì)的親和吸附柱，用PBS溶液平衡親和吸附柱；采用pH＝1.5-2的Gly-HCl溶液對(duì)吸附柱進(jìn)行洗脫，將洗脫的重組人白介素-6蛋白用超濾管以超濾換液的方式置換到pH＝8-9的10-50mM Tris-HCl溶液中，即得純化后的重組人白介素-6。