[發明專利]氧化石墨烯熒光增強型功能核酸水凝膠的制備方法

有效

• 申請號: 202110133085.0
• 申請日: 2021-02-01
• 公開（公告）號: CN112439370B
• 公開（公告）日: 2021-04-23
• 發明（設計）人: 許文濤;黃昆侖;張洋子;朱龍佼;程平
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: B01J13/00
• 分類號: B01J13/00;C09K11/02;C09K11/58;C12Q1/6844
• 代理公司: 北京領科知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11690
• 代理人: 張丹

本發明建立了一種氧化石墨烯熒光增強型功能核酸水凝膠的制備方法。該方法通過分支型滾環擴增（HRCA）技術提高了制備DNA水凝膠的效率，同時將功能核酸序列設計在HRCA反應的模板序列中，為制備出的水凝膠提供可形成如銅納米簇（CuNCs）的熒光金屬納米簇的模板。此外，將氧化石墨烯（GO）納米材料引入制備體系中，降低了HRCA反應體系對CuNCs熒光的影響，顯著增強了CuNCs熒光強度。本發明通過GO的加入、CuNCs的形成提升了水凝膠網絡致密度及粘彈性，同時為以納米花為基礎的微觀結構提供了新的形貌。本發明實現了快速制備熒光增強且通用性強的GO熒光增強型功能核酸水凝膠，在包括分子檢測、生物成像等方面，具有非常好的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物材料領域，具體涉及一種氧化石墨烯熒光增強型功能核酸水凝膠的制備方法。

背景技術

傳統線性滾環擴增（RCA）技術制備DNA水凝膠存在耗時長，直接獲得的RCA水凝膠機械強度低、可利用性較差等問題。同時，RCA反應體系中的酶、二硫蘇糖醇、ATP等物質對熒光功能核酸水凝膠的熒光強度具有較大抑制作用，極大地限制了應用的開發與拓展。此外，基于線性RCA技術獲得的核酸水凝膠微觀形貌單一，并且在制備過程中難以調控其大小及形貌結構。因此，將線性RCA技術替換成分支型RCA（HRCA）技術能夠巧妙地解決以上問題。一方面縮短了傳統線性RCA技術制備DNA水凝膠的時間，進一步擺脫了對人工合成高濃度核酸鏈的依賴；另一方面充分利用了DNA的可編程性將功能核酸序列設計在RCA反應的模板序列中，為獲得的水凝膠提供可形成如熒光銅納米簇（CuNCs）等熒光金屬納米簇的模板。同時，將氧化石墨烯（GO）納米材料引入水凝膠的制備體系中，顯著增強如CuNCs等熒光金屬納米簇的熒光強度，降低了HRCA反應體系對CuNCs熒光的影響。此外，氧化石墨烯功能核酸水凝膠具有較高的粘彈性和獨特的微觀形貌，并實現了通過HRCA反應時間、熒光金屬納米簇的形成體系及GO的濃度進行調節。因此，該方法在包括分子檢測、生物成像等方面，具有非常好的應用前景。

發明內容

本發明建立的核酸水凝膠制備新方法，具有高效制備、熒光增強、形貌可控且通用性強等優點，在包括分子檢測、生物成像等方面，具有非常好的應用前景。

本發明的一個目的是提供一種核酸水凝膠制備方法，所述方法基于一種體外恒溫核酸擴增技術, 所述體外恒溫核酸擴增技術的反應體系包括鎖式探針和連接引物，其特征在于，所述鎖式探針的5’端經過磷酸化修飾且含有與連接引物互補的區域；所述連接引物能夠與鎖式探針的5’端和3’端雜交形成2段相鄰的堿基互補配對區域；

所述互補包括現有技術或公知常識所定義的互補或反向互補，和/或根據現有技術或公知常識所定義的互補原則進行互補或反向互補。

所述聚合酶包括可用于體外核酸擴增技術的聚合酶。

所述連接酶包括可用于體外核酸擴增技術的連接酶。

所述擴增反應體系中的序列包括現有技術或公知常識所定義的序列，公眾可直接人工合成獲得，其制備方法屬于現有技術；所述設計包括現有技術或公知常識所記載的設計方法。

具體的，所述分支型滾環擴增（HRCA）反應還包括以下步驟：

1）所述體外核酸擴增技術包括HRCA反應，所述HRCA的反應過程包括：連接反應和擴增反應兩部分；

2）所述連接反應包括將鎖式探針與引物進行雜交的過程，反應過程包括：80～100℃，5～10min，緩慢降溫；將雜交產物在連接酶的作用下，使鎖式探針生成環化模板的過程，反應過程包括：16～30℃，20min～3h；

3）所述擴增反應包括環化模板與一條連接引物的擴增階段1，和環化模板與兩條引物A、B及氧化石墨烯納米材料的擴增階段2，各階段反應過程包括：30～37℃，2h～8h，最終獲得氧化石墨烯功能核酸水凝膠。

4）所述鎖式探針公眾可直接人工合成獲得，其制備方法屬于現有技術。