[發明專利]氧化石墨烯熒光增強型功能核酸水凝膠的制備方法

有效

• 申請號: 202110133085.0
• 申請日: 2021-02-01
• 公開（公告）號: CN112439370B
• 公開（公告）日: 2021-04-23
• 發明（設計）人: 許文濤;黃昆侖;張洋子;朱龍佼;程平
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: B01J13/00
• 分類號: B01J13/00;C09K11/02;C09K11/58;C12Q1/6844
• 代理公司: 北京領科知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11690
• 代理人: 張丹

1.一種氧化石墨烯熒光增強型功能核酸水凝膠的制備方法，其特征在于，包括由分支型滾環擴增反應HRCA獲得的長單鏈DNA產物，氧化石墨烯納米材料以及熒光銅納米簇制備而成；

所述氧化石墨烯納米材料與分支型滾環擴增反應的雙引物同時加入，通過擴增反應的進行與長單鏈DNA產物發生物理吸附，相互交聯，形成氧化石墨烯-HRCA水凝膠；

所述長單鏈DNA產物為熒光銅納米簇的形成提供成核序列，在加入納米簇形成體系后，能夠在氧化石墨烯-HRCA水凝膠中形成熒光銅納米簇，并在特定波長激發下產生熒光；

所述分支型滾環擴增反應包括一條鎖式探針，所述鎖式探針為SEQ ID NO:1所示序列；

所述納米簇形成體系為抗壞血酸鈉和硫酸銅溶液，形成熒光銅納米簇，在340nm下激發熒光。

2.如權利要求1所述氧化石墨烯熒光增強型功能核酸水凝膠的制備方法，其特征在于，所述分支型滾環擴增反應體系包括一條鎖式探針、一條連接引物和兩條引物A、B；

所述鎖式探針與連接引物通過互補配對并在連接酶作用下連接成環狀模板，再加入含DNA聚合酶的擴增體系后，能夠進行分支型滾環擴增反應的第一階段擴增；

所述兩條引物A、B以第一階段擴增反應獲得的長單鏈DNA為模板，在擴增體系下進行分支型滾環擴增反應第二階段擴增，進一步獲得大量長單鏈DNA產物。

3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述鎖式探針、連接引物和兩條引物A、B具有如下1）-4）的結構：

1）所述鎖式探針序列包括與連接引物互補的連接區域與非鏈接區域；

2）所述鎖式探針序列中的連接區域是分別靠近5’端和3’端，且長度各為10nt的區域，通過與連接引物互補以形成環狀模板；

3）所述鎖式探針序列中的非連接區域設置有長度為20nt的熒光銅納米簇的成核序列，可形成CuNCs的富鳥嘌呤序列，為后續形成CuNCs的熒光銅納米簇提供模板；

4）所述兩條引物A、B序列是與鎖式探針序列中的非連接區域互補，長度為20nt且相互間無重復的核酸序列。

4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述鎖式探針、連接引物和兩條引物A、B具有如下1）-3）的結構：

1）所述鎖式探針序列為序列表中SEQ ID NO：1所示核酸序列5’端經過磷酸化修飾得到核酸序列；

2）所述連接引物為序列表中SEQ ID NO：2所示核酸序列；

3）所述引物A、B為序列表中SEQ ID NO：3和 SEQ ID NO：4所示核酸序列。

5.根據權利要求2-4任一所述的制備方法，其特征在于，按照分支型滾環擴增反應的步驟，連接成環后的鎖式引物與連接引物先進行第一階段擴增，25℃孵育至少1小時，以獲得一定量的第一階段分支型滾環擴增產物。

6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，按照分支型滾環擴增反應的步驟，在獲得一定量的第一階段分支型滾環擴增產物的基礎上，加入氧化石墨烯與兩條引物A、B繼續進行第二階段擴增，25℃孵育至少4h，最終獲得氧化石墨烯功能核酸水凝膠產物。

7.如權利要求6所述制備方法，其特征在于，通過調節氧化石墨烯濃度，以及熒光銅納米簇形成體系，實現熒光納米材料熒光強度的可控；

所述氧化石墨烯濃度為1-20 μg/mL；

所述熒光銅納米簇形成體系包括CuSO₄和抗壞血酸鈉，其中所述CuSO₄濃度為100 μM-500 μM，所述抗壞血酸鈉濃度為2-10 mM。

8.權利要求1-7任一所述制備方法獲得的氧化石墨烯熒光增強型功能核酸水凝膠在分子檢測、生物成像的應用。