[發(fā)明專利]一種髓母細胞瘤細胞的3D培養(yǎng)方法及其在藥物篩選中的應用

有效

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• 申請日: 2021-02-01
• 公開（公告）號: CN112813029B
• 公開（公告）日: 2023-08-18
• 發(fā)明（設計）人: 吳春勇;何原子;張峻穎;康立峰;陳俊根;莊肯
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12Q1/02
• 代理公司: 北京君有知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11630
• 代理人: 焦麗雅

本發(fā)明公開了一種髓母細胞瘤細胞的3D培養(yǎng)體系及其培養(yǎng)方法和在藥物篩選中的應用；所述髓母細胞瘤細胞的3D培養(yǎng)體系，包括3D羥丙基纖維素微孔支架和髓母細胞瘤3D球樣體專用培養(yǎng)基，所述3D球樣體專用培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基添加10％(v:v)胎牛血清和1％(v:v)非必需氨基酸；本發(fā)明3D腫瘤模型具有較佳生長優(yōu)勢，同時可在長時間穩(wěn)定保持其球樣體形態(tài)以及關鍵蛋白的表達，改進了平面培養(yǎng)體系可能導致的細胞基因、蛋白、藥物易感性等各方面的缺陷，更加準確地反映體內(nèi)腫瘤的狀況并預測藥物的藥效，為臨床髓母瘤治療藥物的篩選提供更準確的技術和數(shù)據(jù)支持。

技術領域

本發(fā)明涉及一種細胞的培養(yǎng)方法及其應用，具體涉及一種髓母細胞瘤細胞的3D培養(yǎng)方法及其應用。

背景技術

髓母細胞瘤(Medulloblastoma，MB)是最常見的惡性小兒腦腫瘤。隨著臨床醫(yī)學和基礎研究的發(fā)展，手術聯(lián)合放療再輔以化藥治療的綜合治療措施成為主流的髓母細胞瘤療法，可以幫助延長MB患者的生存期并改善其生活質(zhì)量。然而，手術切除不完全導致的復發(fā)風險以及放療對于發(fā)育期大腦的潛在損害仍然是髓母瘤臨床治療的兩大痛點。因此，化療藥物仍是重要的輔助治療手段。目前常用的化療藥物包括順鉑和長春新堿等，但二者的使用常伴有各種難以逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)毒性，如腱反射喪失和聽力喪失等，如何快速篩選有效且低毒的新型化療藥物是MB治療的焦點問題。

當前常用于MB藥物篩選的模型包括細胞模型、人源腫瘤異種移植模型(Patient-Derived?tumor?Xenograft,PDX)和基因工程小鼠模型。PDX模型和基因工程小鼠模型成本高，建模周期長，難以實現(xiàn)快速、高通量的藥物篩選，人與動物之間的種屬差異也會導致假陽性、假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。因此，操作簡單、成本低，結(jié)果重復性高的細胞模型，是目前最常用的MB體外模型。然而，現(xiàn)有細胞體外模型的培養(yǎng)方式是傳統(tǒng)二維(2D)細胞培養(yǎng)，無法模擬細胞在體內(nèi)多維生長的真實情況，更無法重現(xiàn)細胞間相互作用以及復雜的腫瘤微環(huán)境，在藥效篩選方面有著較大的局限性，通過2D模型得到的篩選數(shù)據(jù)很難轉(zhuǎn)換為臨床有效的治療方案。

三維(3D)細胞培養(yǎng)技術的發(fā)展使得細胞球樣體模型成為一種更具有預測性的腫瘤體外藥物篩選模型。現(xiàn)有構建髓母細胞瘤3D球樣體的方法分為兩類，第一類是低黏附培養(yǎng)法。Bassani團隊將髓母細胞瘤細胞DAOY經(jīng)低黏附板培養(yǎng)后形成的球樣體用于芬維A胺的藥效機制研究；Ivanov團隊利用低黏附培養(yǎng)板將髓母細胞瘤細胞UW-228與人神經(jīng)干細胞共同培養(yǎng)形成細胞球樣體，從而模擬髓母細胞瘤術后病灶處的藥物遞送，但上述報道并未進行藥物篩選實驗。此外，由于低黏附平面不能提供支撐，隨機形成的球樣體難以達到均一的大小和形狀，在日常的培養(yǎng)以及換液過程中也會導致球樣體的損失，這種不確定性一定程度上限制了其應用。第二類為水凝膠基質(zhì)法。Roper團隊通過制備透明質(zhì)酸與聚乙二醇雙丙烯酸酯(PEGDA)的混合物來模擬腦部細胞外基質(zhì)，并將DAOY細胞封裝于上述基質(zhì)中培養(yǎng)，得到的髓母細胞瘤3D模型用于研究藥物反應，但水凝膠本身特性受分子量的影響較大，再加上天然基質(zhì)中不確定成分較多，不同批次的水凝膠組成也可能存在差異，從而影響藥物篩選實驗的準確性和重復性。

3D羥丙基纖維素微孔支架可以很好地克服上述困難，這種細胞支架具有較好的再現(xiàn)性和一致性，支架中特有的孔和通道的排列可在體外高度模擬體內(nèi)微環(huán)境，譬如細胞間相互作用以及營養(yǎng)成分、代謝廢物的交換等。此外，它的多層結(jié)構可為球樣體的生長提供支撐，有效提高細胞球的培養(yǎng)面積，從而極大地提高細胞球樣體的產(chǎn)率。目前利用羥丙基纖維素微孔支架作為細胞支架材料的報道主要集中于肝臟模型的構建，未見用于腦腫瘤模型及藥物篩選的報道。因此，本發(fā)明基于其生物相容性高、成分穩(wěn)定的優(yōu)點，首次利用羥丙基纖維素微孔支架作為細胞支架，構建了髓母細胞瘤的體外3D細胞模型并用于藥物篩選。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有研究的不足，提供一種髓母細胞瘤3D球樣體模型的制備方法和應用。所述模型由羥丙基纖維素和烯丙基異氰酸酯反應形成的具有均勻多孔結(jié)構的支架材料即羥丙基纖維素微孔支架構建，操作簡單，不需要額外的設備，細胞成球率高，在21天內(nèi)可以穩(wěn)定維持球樣體外觀、細胞活力與關鍵蛋白表達。