[發(fā)明專利]一種定量分析抗結(jié)核藥血漿濃度的LC-MS/MS方法

在審

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• 申請日: 2021-01-31
• 公開（公告）號: CN112924613A
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王醫(yī)成;譚志榮;李麗
• 申請（專利權(quán)）人: 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院
• 主分類號: G01N30/89
• 分類號: G01N30/89
• 代理公司: 長沙新裕知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 43210
• 代理人: 劉加

本發(fā)明公開了一種定量分析抗結(jié)核藥血漿濃度的LC?MS/MS方法，該方法通過S1標(biāo)準(zhǔn)工作液配制、S2樣品制備、S3樣品處理、S4樣品檢測及S5標(biāo)準(zhǔn)曲線制作和定量分析，可同時對異煙肼、利福平、吡嗪酰胺及乙胺丁醇進行檢測，樣品前處理過程簡單易操作，所用試劑均為常規(guī)試劑，成本較低。以反相150mm×2.1mm的C18柱、控制流速為0.3mL/min、柱溫為30℃，可以很好地解決異煙肼、利福平、吡嗪酰胺以及乙胺丁醇的極性差異大的問題，分離效果較好，且成本較低。本申請具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確度與精密度，檢測線性范圍寬，檢測時間短，可作為一種可靠的宜推廣的檢測方法用于臨床一線抗結(jié)核病藥物的治療濃度監(jiān)測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于藥物分析技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種定量分析抗結(jié)核藥血漿濃度的LC-MS/MS方法。

背景技術(shù)

結(jié)核病是患者感染結(jié)核分枝桿菌后引起的傳染性疾病，目前臨床上的治療方案是通過多種抗結(jié)核藥物長期聯(lián)合應(yīng)用，其中利福平(Rifampicin，RFP)、異煙肼(Isoniazid，INH)、吡嗪酰胺(Pyrazinamide，PZA)和乙胺丁醇(Ethambutol，EMB)屬于一線抗結(jié)核藥物。由于結(jié)核病患者通常合并其他的病癥，同時使用多種藥物，加之病人個體的差異，造成抗結(jié)核藥物在人體內(nèi)的濃度有很大的差異。體內(nèi)藥物濃度過低，則達不到治療效果；體內(nèi)藥物濃度過高又會引起毒副反應(yīng)。因此，監(jiān)測結(jié)核病患者體內(nèi)抗結(jié)核藥物濃度對于保證治療效果、減少耐藥性及毒副反應(yīng)具有重要意義。

目前國內(nèi)外針對抗結(jié)核藥血漿濃度檢測的方法主要有液相色譜法、液相-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)及超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)，這些方法中，有的是僅檢測一種抗結(jié)核藥物，檢測時間長，檢測成分單一，在聯(lián)合用藥時不太適用。有些方法是同時檢測多種抗結(jié)核藥物，甚至有專利報道同時檢測11種抗結(jié)核藥物，但同時檢測這些藥物的方法，大多使用UPLC-MS/MS法，需要用到UPLC液相色譜儀及UPLC柱，檢測成本較大，不適宜推廣。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服目前存在的技術(shù)缺陷，提供一種定量分析抗結(jié)核藥血漿濃度的LC-MS/MS(液相-串聯(lián)質(zhì)譜)方法。該方法可以同時對人血漿中四種一線抗結(jié)核藥(包括利福平、異煙肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇)進行定量檢測，檢測快速，前處理過程簡單易行，檢測靈敏度高，定量精確，并且可以廣泛適用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種定量分析抗結(jié)核藥血漿濃度的LC-MS/MS方法，包括如下步驟：

S1標(biāo)準(zhǔn)工作液配制：

a、分別精密稱取4種抗結(jié)核藥物標(biāo)準(zhǔn)品，分別用溶劑溶解后并稀釋至標(biāo)準(zhǔn)工作液；分別量取相同體積的所述4種抗結(jié)核藥物的標(biāo)準(zhǔn)工作液并混合，配置得到混合標(biāo)準(zhǔn)液；取所述混合標(biāo)準(zhǔn)液，用甲醇-水溶液稀釋至不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作液和不同濃度的質(zhì)控系列工作液；

b、分別精密稱取內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品，并用甲醇溶解稀釋至內(nèi)標(biāo)工作液的濃度；分別量取所述內(nèi)標(biāo)工作液并混合，配制得到混合內(nèi)標(biāo)液；

S2樣品制備：

a、標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品制備：以空白血漿作為空白基質(zhì)，加入所述標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作液，渦旋混勻，配置不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品；

b、質(zhì)控樣品制備：以空白血漿作為空白基質(zhì)，加入所述質(zhì)控系列工作液，渦旋混勻，配制不同濃度的質(zhì)控樣品；

S3樣品處理：往100μL目標(biāo)樣品中加入800μL所述混合內(nèi)標(biāo)液，震蕩提取5min，15000r/min離心10min，吸取50μL上清液用450μL流動相混合液稀釋，得到待測目標(biāo)樣品；

S4樣品檢測：取步驟S3的待測目標(biāo)樣品2μL進行高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測；