[發(fā)明專(zhuān)利]一種豬流行性腹瀉病毒的引物、試劑盒及應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110131521.0
• 申請(qǐng)日: 2021-01-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112760418A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張蓉;蔣葉林;凌勇;張正林;黃少榮;丁能水;吳有林
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 福建傲農(nóng)生物科技集團(tuán)股份有限公司;漳浦縣趙木蘭養(yǎng)殖有限公司;廈門(mén)嘉燁興農(nóng)業(yè)科技有限公司;福建哈客生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/70
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 上海科盛知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31225
• 代理人: 許耀

本發(fā)明涉及一種豬流行性腹瀉病毒的引物、試劑盒及應(yīng)用，豬流行性腹瀉病毒的引物包括上游引物PEDV?MF和下游引物PEDV?MR，并公開(kāi)了其堿基序列。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明在PEDV的高度保守的E蛋白和M蛋白上跨蛋白設(shè)計(jì)引物，提高引物的敏感性、特異性和穩(wěn)定性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及流行性腹瀉病毒基因檢測(cè)，尤其是涉及一種豬流行性腹瀉病毒的引物、試劑盒及應(yīng)用。

背景技術(shù)

PEDV屬冠狀病毒屬，呈現(xiàn)多形性，大小95-190nm(包括纖突)。核酸為線(xiàn)性單股正鏈RNA，外包衣殼。有囊膜，囊膜上有放射狀纖突。PEDV有纖突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣殼蛋白(N)4種結(jié)構(gòu)蛋白，以及POL(polymerase) 基因編碼的復(fù)制酶1a、1b蛋白和ORF3基因編碼ORF3蛋白。

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種以嘔吐、腹瀉、脫水性下痢為主要臨床癥狀的傳染病。很難與豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis,TGE)進(jìn)行區(qū)分，因此須要通過(guò)PCR進(jìn)行核酸檢測(cè)確診。

一周齡內(nèi)的仔豬病情嚴(yán)重，部分豬吃食后嘔吐，腹瀉3-4d導(dǎo)致嚴(yán)重脫水死亡，病程短且病死率高，病死率可高達(dá)90％，且病毒傳播速度快，因此發(fā)病后及時(shí)對(duì)欄舍內(nèi)的豬群及環(huán)境進(jìn)行篩查，做好隔離工作，阻斷傳染源和傳播途徑十分重要。篩查的過(guò)程則會(huì)消耗大量的檢測(cè)成本，因此有一款成本低且快速精準(zhǔn)的檢測(cè)試劑盒，才能夠快速診斷并及時(shí)采取措施。

發(fā)明內(nèi)容

PEDV的E蛋白和M蛋白同為PEDV的膜糖蛋白，是病毒組裝和出芽的關(guān)鍵蛋白。為保證病毒對(duì)宿主識(shí)別的一致性，在PED病毒的遺傳進(jìn)化過(guò)程中E蛋白和 M蛋白都具有高度的保守性。本發(fā)明在PEDV的高度保守的E蛋白和M蛋白上跨蛋白設(shè)計(jì)引物，提高引物的敏感性、特異性和穩(wěn)定性。經(jīng)過(guò)序列比對(duì)，PEDV各毒株M蛋白和E蛋白的同源性幾乎為100％。因此在E蛋白和M蛋白上設(shè)計(jì)引物能夠最大限度識(shí)別PEDV的所有毒株。

此外，在設(shè)計(jì)RT-PCR的引物時(shí)，要求PCR的產(chǎn)物在500-700bp較為合適，由于RT-PCR產(chǎn)物過(guò)小容易與引物二聚體混淆且穩(wěn)定性較差，PCR產(chǎn)物過(guò)大對(duì)反轉(zhuǎn)錄的要求較高且容易出現(xiàn)錯(cuò)配的情況。然而PEDV的E基因長(zhǎng)度為231bp，M基因長(zhǎng)度為681bp，單獨(dú)作為RT-PCR的產(chǎn)物會(huì)偏小，且在M基因序列中設(shè)計(jì)的擴(kuò)增產(chǎn)物為300bp以上的RT-PCR引物的敏感性和穩(wěn)定性都不理想。本發(fā)明通過(guò)跨E蛋白和M蛋白設(shè)計(jì)RT-PCR引物，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為669bp，提高了引物的敏感性、特異性和穩(wěn)定性。并研制方便診斷的試劑盒，建立相應(yīng)的檢測(cè)方法。

PEDV的基因組中E基因和M基因?yàn)橄噜彽木幋a區(qū)，E基因共編碼76個(gè)氨基酸，不同毒株之間E蛋白3’端氨基酸序列同源性幾乎為100％，且PEDV為RNA 病毒，使用反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為PCR模板，因此PCR產(chǎn)物無(wú)需考慮非編碼區(qū)，可以直接用E基因和M基因的編碼區(qū)拼接后作為模板設(shè)計(jì)引物。

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種豬流行性腹瀉病毒的引物、試劑盒及應(yīng)用。

本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明第一方面提供一種豬流行性腹瀉病毒的引物，包括上游引物PEDV-MF (SEQID NO:1)和下游引物PEDV-MR(SEQ ID NO:2)，分別具有以下堿基序列：

上游引物PEDV-MF：5’-GGGCGCGTGTATAGAGTTTA-3’，

下游引物PEDV-MR：5’-GACATAGAAAGCCCAACCAG-3’。

本發(fā)明第二方面提供一種豬流行性腹瀉病毒的試劑盒，含有所述的引物，并記為PCR Mix。