[發明專利]一種豬流行性腹瀉病毒的引物、試劑盒及應用

在審

• 申請號: 202110131521.0
• 申請日: 2021-01-30
• 公開（公告）號: CN112760418A
• 公開（公告）日: 2021-05-07
• 發明（設計）人: 張蓉;蔣葉林;凌勇;張正林;黃少榮;丁能水;吳有林
• 申請（專利權）人: 福建傲農生物科技集團股份有限公司;漳浦縣趙木蘭養殖有限公司;廈門嘉燁興農業科技有限公司;福建哈客生態農業有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 許耀

1.一種豬流行性腹瀉病毒的引物，其特征在于，包括上游引物PEDV-MF和下游引物PEDV-MR，分別具有以下堿基序列：

上游引物PEDV-MF：5’-GGGCGCGTGTATAGAGTTTA-3’，

下游引物PEDV-MR：5’-GACATAGAAAGCCCAACCAG-3’。

2.一種豬流行性腹瀉病毒的試劑盒，其特征在于，含有權利要求1所述的引物，并記為PCR Mix。

3.根據權利要求2所述的一種豬流行性腹瀉病毒的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括陽性對照、陰性對照、反轉錄試劑和PCR擴增液。

4.根據權利要求2或3所述的一種豬流行性腹瀉病毒的試劑盒，其特征在于，PCR Mix中，上游引物PEDV-MF和下游引物PEDV-MR的摩爾比為1:1。

5.根據權利要求3所述的一種豬流行性腹瀉病毒的試劑盒，其特征在于，所述的陽性對照為含有PEDV基因序列的重組質粒。

6.根據權利要求3所述的一種豬流行性腹瀉病毒的試劑盒，其特征在于，所述的陰性對照為雙蒸水。

7.根據權利要求3所述的一種豬流行性腹瀉病毒的試劑盒，其特征在于，所述的PCR擴增液包括Taq PCR Mix(2×)。

8.如權利要求2～7任一所述的豬流行性腹瀉病毒的試劑盒的應用，其特征在于，將其應用于豬流行性腹瀉病毒的檢測，包括以下步驟：

(1)提取待測樣品的總RNA，加入反轉錄試劑，反轉錄得到樣品cDNA備用；

(2)配置反應體系：取樣品cDNA、PCR Mix、PCR擴增液，并用雙蒸水定量至一定體積，配制反應體系；

(3)RT-PCR擴增；

(4)瓊脂糖凝膠電泳；

(5)參照待測樣品對陽性對照和陰性對照進行處理；

(6)結果判定。

9.根據權利要求8所述的豬流行性腹瀉病毒的試劑盒的應用，其特征在于，步驟(6)中的結果判定方法為：

陽性對照出現669bp擴增條帶，陰性對照無條帶出現時，實驗結果成立；被檢測樣品出現669bp的擴增條帶為豬流行性腹瀉病毒核酸陽性，否則為陰性。

10.根據權利要求8所述的豬流行性腹瀉病毒的試劑盒的應用，其特征在于，包括以下條件中的任一項或多項：

(i)步驟(1)中，取RNA4μg，反轉錄的條件為：42℃下進行45min；

(ii)步驟(2)的反應體系中，樣品cDNA 2μL，PCR Mix 2μL，PCR擴增液12.5μL，并加入雙蒸水10.5μL定量至25μL；

(iii)步驟(3)中，擴增程序為：94℃5min，循環為94℃30s，55℃30s，72℃1min，共計35個循環，72℃10min；

(iv)步驟(4)中，瓊脂糖凝膠電泳的方法為：將瓊脂糖放入TAE中，制得1％的瓊脂糖凝膠，微波溶解，再加入5μL的核酸染料輕輕搖勻，在電泳槽內放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后取10μL PCR擴增產物，點樣于瓊脂糖凝膠孔中，以110-120V電壓于TAE電泳緩沖液中電泳，待Marker和條帶都跑開后，由凝膠成像儀觀察并拍照，獲得檢測結果。