[發明專利]一種來源于南極細菌的耐低溫磷脂酶D及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202110129291.4
• 申請日: 2021-01-29
• 公開（公告）號: CN112899256B
• 公開（公告）日: 2023-03-21
• 發明（設計）人: 王永華;王方華;劉思雨;楊博;藍東明
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/64;C12R1/19
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 宮愛鵬

本發明公開了一種來源于南極細菌的耐低溫磷脂酶D及其制備方法和應用，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；該耐低溫磷脂酶D基因序列如SEQ IDNO:2所示。本發明獲得一株耐低溫磷脂酶D的大腸桿菌重組表達菌株，利用該菌株，可實現重組蛋白大量可溶性表達，易于后期純化及蛋白獲得。本發明的表達產物具備有良好的低溫儲藏穩定性和良好的酶活力，同時對有機溶劑和表面活性劑有一定的耐受性。本發明獲得磷脂酶D可適用于磷脂改性，生產磷脂酸及各類天然稀有磷脂和非天然磷脂化合物，應用于生物、食品、醫藥、化妝品、農業、工業等領域。

技術領域

本發明屬于酶的基因工程技術領域，具體的說，涉及一種優化的南極細菌來源的耐低溫磷脂酶D重組大腸桿菌菌株及酶蛋白制備方法；本發明還涉及所表達的耐低溫磷脂酶D的應用。

背景技術

磷脂酶D(Phospholipase D，PLD，EC3.1.4.4)是一類水解磷脂結構中的磷酸二酯鍵生成磷脂酸(PA)和相應含羥基化合物的酶。PLD可通過其水解產物PA發揮第二信使功能并參與多種生理活動，如細胞增殖、炎癥、病毒感染等，也能導致神經退行性疾病、人類癌癥和植物應激反應。除此之外，磷脂酶D也可以催化轉磷脂?；磻?，合成具有生理功能的磷脂衍生物，如磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PE)等。因此，作為一類重要的工具酶，PLD在磷脂改性中發揮著重要作用，在食品、醫藥和化妝品行業中具有極大的應用價值。

目前，限制磷脂酶D得以廣泛應用的主要原因有以下幾點：一是商品化磷脂酶D來源范圍較窄，種類少。國際上商品化磷脂酶D主要被日本天野公司所壟斷，且其來源大多為鏈霉菌屬，種類稀少，價格昂貴。國內對磷脂酶D的研究也才剛剛起步，還未開發出商品化PLD。二是現已報道的磷脂酶D的表達量和酶活力都普遍較低。天然磷脂酶D難以提取純化，且獲得的產量較低，生產成本高，難以工業化生產。而基因工程菌異源表達的磷脂酶D主要以包涵體形式存在且酶活力較低，從而限制了磷脂酶D的規?；苽?。三是報道的大多數磷脂酶D在低溫下酶活力會被抑制，且儲藏期較短，這嚴重影響了該酶的應用和保存。因此，開發一種高表達高活力的低溫穩定性磷脂酶D具有重要意義。

發明內容

為解決現有技術的缺點和不足之處，本發明的目的在于提供一種南極細菌來源的耐低溫磷脂酶D及其制備方法。

本發明的第一個方面公開了一種來自南極細菌(Moritella sp.JT01)的耐低溫磷脂酶D，其含有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

本發明的另一個方面，提供了一種編碼上述磷脂酶D的優化的核酸序列，獲得在大腸桿菌高表達的耐低溫磷脂酶D，具有如SEQ ID NO：2所示的核酸序列。

本發明的第三個方面，提供了一種重組表達載體，其包含上述多核苷酸。

本發明的第四個方面，提供了一種細胞，其包含上述載體，或其基因組中整合有上述多核苷酸。

本發明的第五個方面，表征了上述磷脂酶D的酶學性質。

本發明的第六個方面，提供了一種生產上述磷脂酶D的方法，包括：培養上述宿主細胞，從培養物中純化出表達產物。

本發明的第七個方面，提供了上述磷脂酶D的用途，可應用于磷脂改性中。

本發明的技術方案具體如下：

一種來源于南極細菌的耐低溫磷脂酶D，是在對NCBI數據庫中提供的南極細菌(Moritella sp.JT01)磷脂酶D完整蛋白序列(GenBank:KXO13223.1)基礎上去除N端28個氨基酸基礎上獲得(命名為MsPLD)，其氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示。