[發(fā)明專利]一種來源于南極細菌的耐低溫磷脂酶D及其制備方法和應(yīng)用有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 202110129291.4 | 申請日： | 2021-01-29 |
| 公開（公告）號： | CN112899256B | 公開（公告）日： | 2023-03-21 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 王永華;王方華;劉思雨;楊博;藍東明 | 申請（專利權(quán)）人： | 華南理工大學(xué) |
| 主分類號： | C12N9/16 | 分類號： | C12N9/16;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/64;C12R1/19 |
| 代理公司： | 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245 | 代理人： | 宮愛鵬 |
| 地址： | 510640 廣*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 來源于 南極 細菌 低溫 磷脂酶 及其 制備 方法 應(yīng)用 | ||
1.一種來源于南極細菌的耐低溫磷脂酶D，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示。
2.一種耐低溫磷脂酶D基因，其特征在于，其基因序列如SEQ ID NO:2所示。
3.包含權(quán)利要求2所述磷脂酶D基因的表達載體。
4.一種細胞，包含權(quán)利要求3所述的表達載體，或其基因組中整合有權(quán)利要求2所述的磷脂酶D基因。
5.一種耐低溫磷脂酶D重組菌株的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
(1)將權(quán)利要求2所述耐低溫磷脂酶D基因克隆到pET-21a表達載體上，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒；
(2)將所得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Shuffle T7感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆，獲得重組大腸桿菌表達菌株。
6.一種重組耐低溫磷脂酶D的制備方法，其特征在于，以權(quán)利要求5獲得的重組大腸桿菌表達菌株為發(fā)酵菌株進行液體發(fā)酵，制得重組耐低溫磷脂酶D。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，具體步驟如下：
(1)將重組大腸桿菌表達菌株接種于含氨芐青霉素的種子培養(yǎng)基中，于37±2℃，搖瓶培養(yǎng)至對數(shù)生長期，制備種子液；
(2)將所述種子液按5～10％的接種量接種到LB液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37±2℃，搖瓶培養(yǎng)至OD600＝0.6～0.8，再添加IPTG至終濃度0.2mM，于16-20℃，搖瓶條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)；
(3)將步驟(2)中所得發(fā)酵液離心，收集菌體沉淀，用緩沖液重懸并超聲破碎細胞，將細胞破碎液離心，取上清，即為重組耐低溫磷脂酶D粗酶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，將步驟（3）所得重組耐低溫磷脂酶D粗酶液，分別經(jīng)鎳柱親和層析、G-25脫鹽柱純化獲得電泳純的重組耐低溫磷脂酶D酶液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，步驟（3）重懸的緩沖液為50 mM Tris-HCl，500 mM NaCl，pH8.0；所述鎳柱親和層析所用的洗脫緩沖液為含有300 mM咪唑的50 mMTris-HCl，500 mM NaCl ，pH8.0；G-25脫鹽柱純化中所用的洗脫緩沖液為50 mM Tris-HCl，500 mM NaCl ，pH8.0。
10.權(quán)利要求1所述耐低溫磷脂酶D的應(yīng)用，其特征在于，該磷脂酶D用于催化合成磷脂酸或磷脂酰絲氨酸。
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