[發明專利]一種細胞殺傷效力的檢測方法、系統及其應用

有效

• 申請號: 202110127301.0
• 申請日: 2021-01-29
• 公開（公告）號: CN112813133B
• 公開（公告）日: 2022-07-15
• 發明（設計）人: 姜晶
• 申請（專利權）人: 上海睿鈺生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;G01N21/64
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發明提供一種細胞殺傷效力的檢測方法、系統及其應用。所述檢測方法包括如下步驟：獲取細胞計數板上共培養樣品的顯微圖像，所述共培養樣品為靶細胞與效應細胞共培養得到的細胞樣品，所述靶細胞攜帶第一熒光標記，所述共培養樣品至少使用一種第二熒光標記進行染色標記，所得顯微圖像包括明場顯微圖像、第一熒光顯微圖像和至少一張第二熒光顯微圖像，而后，對所述明場顯微圖像、所述第一熒光顯微圖像及所述至少一張第二熒光顯微圖像進行疊加合成分析并計數，得到細胞殺傷效力的檢測結果。該檢測方法能夠同時得到待測細胞的圖像信息和數據處理結果，所得結果更加直觀，檢測步驟少且檢測效率高。

技術領域

本發明屬于細胞殺傷活性檢測技術領域，具體涉及一種細胞殺傷效力的檢測方法、系統及其應用。

背景技術

細胞殺傷效力的檢測對于免疫細胞治療產品的質量控制具有重要的意義。由于免疫細胞治療產品具有起始個體差異大、制備工藝規?；潭鹊?、制劑多為活細胞產品、作用機制不是很明確等，使得這類產品的一致性差、批量有限、效期短、同一類產品的可比性差等特點，所以免疫細胞治療產品的質控研究較為復雜，其中殺傷效力質量控制便是難點之一。

目前，常用的細胞殺傷檢測方法有鎘51釋放實驗、乳酸脫氫酶(LDH)釋放法、BATDA法、CAM法、CytoTox-Glo法和PKH法等。例如，鎘51釋放實驗、LDH法、BATDA法和CytoTox-Glo法都屬于間接法，即先用某一試劑對靶細胞進行標記，然后和不同濃度的免疫細胞進行孵育，當靶細胞受到免疫細胞的攻擊而損傷時，細胞膜通透性改變，這些物質會釋放到上清中，通過測定釋放物質的含量可以測定免疫細胞的活性。上述方法都是通過釋放物質含量的測定而間接進行定量，反應時間的長短、儀器檢測的時間點都會對讀取的數值造成影響。

其中經典的方法是鎘51釋放實驗，該方法可重復性好，但是，因其使用同位素標記靶細胞，從而存在半衰期短、同位素廢棄物處理及實驗防護要求高等多種限制因素，尤其是放射性同位素的使用對健康以及環境具有巨大威脅，其他放射性同位素標記靶細胞如H3亦具有此類缺陷，使該類方法的應用受到局限，因此，很多研究者會采用其它替代方法進行生物學效力檢測。

傳統的LDH法靈敏度及可重復性不穩定，且所需時間較長，批間變異較大，不能適應免疫細胞效期短的特點。CAM法及PKH法是通過流式細胞儀檢測活細胞標記及死亡標記雙信號來反映其殺傷效率，與前述方法相比，這兩種方法所反映的信號還包括處于凋亡狀態的細胞。

流式細胞術(Flow Cytometry，FCM)是一種在液流系統中快速測定單個細胞或細胞器的生物學性質，并把特定的細胞或細胞器從群體中加以分類收集的技術。鑒于其在單細胞水平上高效準確的定量分析優勢，目前涌現出多種以流式細胞術為基礎的NK細胞殺傷活性的測定方法，但仍然存在缺陷。由于效應細胞和靶細胞在共培養過程中，靶細胞對效應細胞可能會產生一定抑制和破壞作用，則共培養體系的死亡率可能是包括靶細胞和效應細胞的共同死亡率。其次，盡管流式細胞術能夠特異性地檢測靶細胞的凋亡率，流式細胞儀屬于液流系統，無法采集到細胞圖像，若需要驗證結果的準確性，還需要借助顯微鏡或其他儀器觀察。

此外，在進行病人的免疫水平評價，腫瘤治療愈后評價，以及細胞治療過程中的免疫細胞的增殖能力評價等環節中，也都需要對免疫細胞的殺傷能力進行評估。

因此，開發一種直觀地、準確地檢測殺傷效力的檢測方法，對于免疫細胞制品的研發或免疫細胞療法的發展具有重要的意義。

發明內容

鑒于現有技術中存在的問題，本發明提供一種細胞殺傷效力的檢測方法、系統及其應用。所述方法先通過對靶細胞和免疫細胞進行熒光染色，區分活靶細胞、死靶細胞、活效應細胞和死效應細胞，并結合熒光顯微成像和圖像合成分析方法，根據對應細胞個數計算得到細胞殺傷率。

為達此目的，本發明采用以下技術方案：

第一方面，本發明提供一種細胞殺傷效力的檢測方法，所述檢測方法包括如下步驟：