[發明專利]一種多酶復合體及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202110118309.0
• 申請日: 2021-01-28
• 公開（公告）號: CN112877347B
• 公開（公告）日: 2023-02-17
• 發明（設計）人: 楊博;張細珍;馬云建;王永華;吳斌;仲宣儒;藍東明
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;C07K19/00;C12P5/00;C12R1/19
• 代理公司: 廣州廣典知識產權代理事務所(普通合伙) 44365
• 代理人: 萬志香

本發明涉及一種TLL?CvFAP多酶復合體及其構建方法和應用，所述構建方法，包括先構建TLL?linker?SpyCatcher重組蛋白工程菌和CvFAP?linker?SpyTag重組蛋白工程菌，然后進行表達，得到CvFAP?linker?SpyTag蛋白和TLL?linker?SpyCatcher蛋白，將上述兩種蛋白在胞外混合，進行自組裝，得到TLL?CvFAP多酶復合體。所述的TLL?CvFAP多酶復合體作為催化劑在油脂生產烷(烯)烴中應用，提高級聯反應的催化效率和烷(烯)烴的得率。

技術領域

本發明屬于生物酶催化領域，具體涉及一種新的光脫羧酶(CvFAP)-脂肪酶的多酶復合體及其構建方法和應用。

背景技術

石油能源的日益減少和環境的不斷惡化加速了可持續發展道路的研究進程。開發利用可再生生物質資源生產生物燃料的技術，以生物燃料替代石油燃料，成為各國相關研究者科學研究的重要任務。在可再生的生物質資源中，以餐飲廢油、非食用油等為代表的油脂近年來受到廣泛關注。脂肪酸作為油脂水解產物的最主要成分，僅需脫去一個羧基即可形成各類烷(烯)烴，與石油成分近乎完美匹配。因此，利用非食用油及廢油經水解生成脂肪酸，進一步經脫羧制備烷(烯)烴，已成為目前相關行業研究的焦點。

通過多酶級聯催化油脂水解脫羧制備烷(烯)烴，能克服傳統化學法制備能耗高、污染重、專一性差等諸多難題。目前，該級聯反應專用酶主要由催化油脂水解的脂肪酶和催化脂肪酸脫羧的脫羧酶構成。一方面，相對于研究時間較長、成熟度較高的脂肪酶，脫羧酶仍處于探索發展階段；另一方面，多酶級聯反應存在酶兼容性差、催化效率低下等問題。因此，尋找高效的新型脫羧酶并探索催化效率高的多酶級聯體系是該行業突破瓶頸的關鍵。近年來開發了諸如P450類脂肪酸脫羧酶、末端烯烴酶(OleT_JE)等多種脫羧酶，但大多數脫羧酶存在催化效率低，需額外添加昂貴的輔因子等缺點。

2017年，Science報道了Fred Beisson等發現的一種來源于微藻的新型光脫羧酶(Chlorella variabilis fatty acid photodecarboxylase，CvFAP)可利用藍光催化飽和/不飽和脂肪酸轉化生成烷(烯)烴，無需添加昂貴輔因子，只需利用藍光就能將脂肪酸轉化為烷(烯)烴，CvFAP代表全新的應用領域。若能夠擴大這種反應的規模，所得烴類產物極有可能改變當今能源結構，并大力推進光驅動酶的研究。目前針對該酶的研究主要集中在其催化機理和催化性質，利用油脂進行級聯催化的報道還較少。

近年來，受天然多酶復合體的啟發，很多研究者嘗試構建人工多酶復合體，期望通過在不同酶分子之間搭建底物通道，來提高人工代謝途徑和體外多酶催化系統的轉化效率。目前有效的多酶組裝方法包括載體連接的共固定、蛋白共價交聯、蛋白融合、生物大分子骨架連接的多酶組裝以及無骨架多酶自組裝技術等。其中，無骨架自組裝多酶催化體系能有效克服基因融合、蛋白骨架系統等技術在多酶復合體系構建中存在的缺陷，實現多種酶蛋白在二維空間的有序組裝。SpyTag/SpyCatcher自反應系統高效穩定的共價偶聯特征使其成為一個很有潛力的蛋白組裝工具。目前以SpyTag/SpyCatcher為功能模塊組裝無骨架多酶復合體的研究仍處于起步階段。

本發明將光脫羧酶和脂肪酶聯用，首次利用SpyTag/SpyCatcher自反應系統開發一種體外自組裝構建CvFAP-脂肪酶多酶復合體的方法，并將該多酶復合體應用于催化油脂轉化制備烷(烯)烴，旨在提高CvFAP-脂肪酶級聯催化油脂轉化為烷(烯)烴反應的催化效率，為降低生物燃料的合成成本、提高生產效率提供技術支持。

發明內容

本發明的目的之一在于提供一種TLL-linker-SpyCatcher重組蛋白工程菌的構建方法。

實現上述目的的技術方案如下。

一種TLL-linker-SpyCatcher重組蛋白工程菌的構建方法，包括以下步驟：