[發(fā)明專利]一種多酶復(fù)合體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110118309.0
• 申請(qǐng)日: 2021-01-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112877347B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-02-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊博;張細(xì)珍;馬云建;王永華;吳斌;仲宣儒;藍(lán)東明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華南理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/62
• 分類號(hào): C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;C07K19/00;C12P5/00;C12R1/19
• 代理公司: 廣州廣典知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44365
• 代理人: 萬(wàn)志香

1.一種TLL-CvFAP多酶復(fù)合體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：將CvFAP-linker–SpyTag重組蛋白和TLL-linker-SpyCatcher重組蛋白在胞外混合，進(jìn)行自組裝，得到TLL-CvFAP多酶復(fù)合體；

所述CvFAP-linker-SpyTag重組蛋白中的CvFAP的核苷酸表達(dá)序列如SEQ ID NO.1，所述linker的氨基酸序列為(EAAAK)₂，所述的SpyTag的核苷酸表達(dá)序列如SEQ ID NO.3；和/或所述CvFAP-linker-SpyTag重組蛋白是由包括以下步驟的方法構(gòu)建的CvFAP-linker-SpyTag重組蛋白工程菌表達(dá)得到：

1)以pET28a-CvFAP為模板，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6為引物，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增和PCR產(chǎn)物純化后，進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得pET28a-CvFAP-linker-SpyTag陽(yáng)性質(zhì)粒；

2)將獲得的陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主細(xì)胞中，得到CvFAP-linker-SpyTag重組蛋白工程菌；

所述TLL-linker-SpyCatcher重組蛋白中的TLL的核苷酸表達(dá)序列如SEQ IDNO.2，linker的氨基酸序列為(GGGGS)₂，SpyCatcher的核苷酸表達(dá)序列如SEQ ID NO.4；和/或所述TLL-linker-SpyCatcher重組蛋白是由包括以下步驟的方法構(gòu)建的TLL-linker-SpyCatcher重組蛋白工程菌表達(dá)得到：

1)以pET28a-TLL為模板，以SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8為引物，擴(kuò)增得到含有Not I和Sal I酶切位點(diǎn)的質(zhì)粒pET28a-5’Sal I-TLL-3’Not I；

2)然后以pET23a-SpyCatcher為模板，以SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10為引物，擴(kuò)增得到含有5’Sal I-linker-SpyCatcher-3’Not I的基因片段；將該基因片段和質(zhì)粒pET28a-5’Sal I-TLL-3’Not I分別使用Not I/Sal I酶切后，經(jīng)PCR產(chǎn)物純化后，進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，獲得陽(yáng)性質(zhì)粒；

3)將獲得的陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主細(xì)胞中，得到TLL-linker-SpyCatcher重組蛋白工程菌。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的TLL-CvFAP多酶復(fù)合體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的TLL-CvFAP多酶復(fù)合體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述大腸桿菌是大腸桿菌BL21(DE3)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的TLL-CvFAP多酶復(fù)合體的構(gòu)建方法，其特征在于，自組裝時(shí)間為10-13小時(shí)；和/或自組裝時(shí)的pH為6.0-8.0。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的TLL-CvFAP多酶復(fù)合體的構(gòu)建方法，其特征在于，自組裝時(shí)的pH為7.0±0.4；和/或自組裝時(shí)的溫度為30±5攝氏度。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的TLL-CvFAP多酶復(fù)合體的構(gòu)建方法，其特征在于，自組裝時(shí)的pH為6.8-7.2，自組裝時(shí)的溫度為30±2攝氏度。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述構(gòu)建方法得到的TLL-CvFAP多酶復(fù)合體。

8.權(quán)利要求7所述的TLL-CvFAP多酶復(fù)合體作為催化劑在油脂生產(chǎn)烷(烯)烴中應(yīng)用。

9.一種油脂生產(chǎn)烷(烯)烴的方法，其特征在于，使用的催化劑為權(quán)利要求7所述的TLL-CvFAP多酶復(fù)合體。