[發明專利]一種NK細胞及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202110112416.2
• 申請日: 2021-01-27
• 公開（公告）號: CN112725273A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 趙禮軍;熊建民
• 申請（專利權）人: 河南省華隆生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N5/10;A61K35/17;A61P37/02;A61P35/00;A61P31/12
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

本發明涉及一種NK細胞及其制備方法和應用。所述制備方法包括利用工程化K562細胞誘導培養臍帶血單個核細胞，得到NK細胞。所述工程化K562細胞表達細胞因子CD19、CD86、IL21、CD64和CD137L，能夠高效擴增激活臍帶血單個核細胞，所制備的NK細胞具有較高的擴增數量和細胞活力，且工程化K562細胞使用量低，能夠有效降低成本。

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，涉及一種NK細胞及其制備方法和應用。

背景技術

自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)是機體重要的免疫細胞，不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調節有關，是人體抵抗癌細胞和病毒感染的第一道防線，可非特異性直接殺傷腫瘤細胞，還具有免疫調節功能，能夠與機體其它多種免疫細胞相互作用，調節機體的免疫狀態和免疫功能。臨床研究發現NK細胞過繼性免疫治療惡性腫瘤具有良好的應用前景，對多種實體瘤和血液系統惡性腫瘤均有一定效果。

現有的NK細胞擴增培養技術主要包括，因子法：抽取外周血或利用單細胞采集機并結合淋巴細胞分離液獲得外周血單個核細胞(PBMC)，然后直接培養或分選PBMC中的NK細胞，在普通的淋巴細胞培養基中單獨使用細胞因子或聯合飼養層細胞擴增NK；抗體包被法：在抗體包被的培養瓶中用普通淋巴細胞培養基擴增培養PBMC或分選后的NK細胞；專用NK培養基：購買專用的NK培養基從PBMC中特異性擴增NK細胞或者對分選后的NK細胞進行擴增；干細胞誘導：將干細胞誘導分化成NK細胞，然后進行擴增。

CN105238754A公開了一種高增殖力和高殺傷力NK細胞的體外培養方法，所述方法包括使用抗人CD3單克隆抗體和抗人CD16單克隆抗體包被的細胞培養瓶擴增培養PBMC，獲得NK細胞，無需使用滋養層細胞。但NK擴增數量、純度及NK細胞活力上都難以滿足臨床需求。

CN104894072A提供了一種自體自然殺傷細胞增殖培養的制備方法，所述方法包括使用3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1和CD122轉染并穩定表達的K562細胞和白介素2擴增激活來自于癌癥患者自身的單個核細胞，獲得自然殺傷細胞，自然殺傷細胞增殖倍數達到2500倍以上，具有很強殺傷毒性，但滋養層細胞的用量較大，成本較高。

綜合上述，提供一種NK細胞制備方法，成本低，所制備的NK細胞具有較高的擴增數量和細胞活力，對于NK細胞制備領域具有重要意義。

發明內容

針對現有技術的不足和實際需求，本發明提供一種NK細胞及其制備方法和應用，所述制備方法利用工程化K562細胞誘導培養臍帶血單個核細胞，能夠高效制備NK細胞，所制備的NK細胞具有較高的擴增數量和細胞活力。

為達上述目的，本發明采用以下技術方案：

第一方面，本發明提供一種NK細胞的制備方法，所述制備方法包括利用工程化K562細胞誘導培養臍帶血單個核細胞，得到NK細胞。

本發明的制備方法中，工程化K562細胞能夠高效擴增激活臍帶血單個核細胞，所制備的NK細胞具有較高的擴增數量和細胞活力，且工程化K562細胞使用量低，能夠有效降低成本。

優選地，所述工程化K562細胞表達膜蛋白CD19、CD86、IL21、CD64和CD137L。

優選地，所述IL-21通過與CD8α跨膜區融合表達在所述工程化K562細胞表面。

優選地，所述工程化K562細胞的基因組整合有CD19編碼基因、CD86編碼基因、IL21-CD8α編碼基因、CD64編碼基因和CD137L編碼基因。

優選地，所述CD19編碼基因包括SEQ ID NO:1所示的核酸序列。

SEQ ID NO:1：