[發明專利]一種NK細胞及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202110112416.2
• 申請日: 2021-01-27
• 公開（公告）號: CN112725273A
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 趙禮軍;熊建民
• 申請（專利權）人: 河南省華隆生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N5/10;A61K35/17;A61P37/02;A61P35/00;A61P31/12
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟

1.一種NK細胞的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括利用工程化K562細胞誘導培養臍帶血單個核細胞，得到NK細胞。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述工程化K562細胞表達膜蛋白CD19、CD86、IL21、CD64和CD137L；

優選地，所述IL-21通過與CD8α跨膜區融合表達在所述工程化K562細胞表面。

3.根據權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述工程化K562細胞的基因組整合有CD19編碼基因、CD86編碼基因、IL21-CD8α編碼基因、CD64編碼基因和CD137L編碼基因。

4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述CD19編碼基因包括SEQ ID NO:1所示的核酸序列；

優選地，所述CD86編碼基因包括SEQ ID NO:2所示的核酸序列；

優先地，所述IL21-CD8α編碼基因包括SEQ ID NO:3所示的核酸序列；

優先地，所述CD64編碼基因包括SEQ ID NO:4所示的核酸序列；

優先地，所述CD137L編碼基因包括SEQ ID NO:5所示的核酸序列。

5.根據權利要求1-4任一項所述的制備方法，其特征在于，所述NK細胞的制備方法包括間斷性利用工程化K562細胞誘導培養的步驟。

6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述間斷性利用工程化K562細胞誘導培養包括以下步驟：

(1)將臍帶血單個核細胞與工程化K562細胞加入培養液中進行混合培養，并加入胎牛血清和硫酸慶大霉素；

(2)在培養第2～6天，離心收集細胞，加入培養液、胎牛血清和硫酸慶大霉素重懸細胞，繼續培養；

(3)在培養第7～8天，加入工程化K562細胞、培養液、胎牛血清和硫酸慶大霉素，繼續培養；

(4)在第8～14天，加入培養液、胎牛血清和硫酸慶大霉素，繼續培養；

(5)在培養第14～16天，收集細胞，獲得所述NK細胞。

7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述培養液包括GT-T561培養液；

優選地，所述胎牛血清在所述培養液中的質量百分比為1％～10％；

優選地，所述硫酸慶大霉素的終濃度為80～100U/mL。

8.根據權利要求1-7任一項所述的制備方法，其特征在于，所述NK細胞的制備方法包括以下步驟：

(1)分離臍帶血單個核細胞，與工程化K562細胞加入培養液中進行混合培養，所述培養液中含5％～10％胎牛血清和80～100U/mL硫酸慶大霉素；

(2)在培養第2～3天，離心收集細胞，加入含5％～10％胎牛血清和80～100U/mL硫酸慶大霉素的GT-T561培養液重懸細胞，繼續培養；

(3)在培養第4～6天，加入含1％～2％胎牛血清和80～100U/mL硫酸慶大霉素的GT-T561培養液，繼續培養；

(4)在培養第7～8天，加入工程化K562細胞，采用含1％～2％胎牛血清和80～100U/mL硫酸慶大霉素的GT-T561培養液，繼續培養；

(5)在培養第8～14天，加入含1％～2％胎牛血清和80～100U/mL硫酸慶大霉素的GT-T561培養液，繼續培養；

(6)在培養第14～16天，收集細胞，獲得所述NK細胞。

9.一種NK細胞，其特征在于，所述NK細胞由權利要求1-8任一項所述的制備方法制備得到。

10.權利要求9所述的NK細胞在制備細胞免疫治療藥物中的應用。