[發明專利]分析溴氰蟲酰胺和氯蟲苯甲酰胺殘留的VHH-ELISA試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 202110112240.0
• 申請日: 2021-01-27
• 公開（公告）號: CN112920277B
• 公開（公告）日: 2022-08-09
• 發明（設計）人: 王楷;徐波杰;許艇;譚兵;薛銜樂;黃澤愷
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C07K16/44
• 分類號: C07K16/44;C07K14/765;C07K14/77;C07K14/795;C07K14/435;C12N15/13;C07D401/04;G01N33/58;G01N33/543;G01N33/53
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 盛大文

1.抗溴氰蟲酰胺和氯蟲苯甲酰胺的納米抗體，其特征在于，所述納米抗體包含如下的氨基酸序列或由其組成：

i)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或

ii)在i)的N端和/或C端連接標簽得到的氨基酸序列。

2.編碼權利要求1所述抗溴氰蟲酰胺和氯蟲苯甲酰胺的納米抗體的核酸分子。

3.含有權利要求2所述編碼所述抗溴氰蟲酰胺和氯蟲苯甲酰胺的納米抗體的核酸分子的生物材料，所述生物材料為重組DNA、表達盒、轉座子、質粒載體、噬菌體載體、病毒載體或工程菌。

4.溴氰蟲酰胺和氯蟲苯甲酰胺檢測試劑或試劑盒，其特征在于，有效成分為權利要求1所述溴氰蟲酰胺和氯蟲苯甲酰胺的納米抗體。

5.溴氰蟲酰胺半抗原的制備方法，其特征在于，將氨基酸與2-(3-溴-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-吡啶基)-8-甲基-4-氧代-4H-苯并[d][1，3]惡嗪-6-甲腈進行縮合反應，所述氨基酸以4-氨基戊酸為例，具體包括如下步驟：

1)將2-氨基-3-甲基苯甲酸(200g，1.32mol)溶解在配有機械攪拌的700mL二甲基甲酰胺中，然后將溶液加熱至68℃；將N-碘代琥珀酰亞胺(NIS，300g，1.33mol)緩慢加入燒瓶中，然后在75℃下攪拌3小時；將反應混合物緩慢倒入1L冰水中，攪拌3小時；過濾和干燥后獲得灰色固體2-氨基-5-碘-3-甲基苯甲酸；

2)將2-氨基-5-碘-3-甲基苯甲酸(138.5g，0.5mol)和氰化亞銅(58.2g，0.65mol)加入到1L二甲基甲酰胺中，將混合物加熱，并在油浴中保持6小時；反應完成后，通過減壓蒸餾除去大部分溶劑，然后用1L水和50mL乙二胺處理殘余物；過濾混合物，用2M鹽酸將濾液酸化至pH 5，并攪拌過夜， 通過過濾和干燥獲得灰色固體2-氨基-5-氰基-3-甲基苯甲酸；

3)將2-氨基-5-氰基-3-甲基苯甲酸(38g，0.22mol)溶解400mL 1，4-二氧六環中，用油浴加熱至102℃；將三光氣(22.7g，0.075mol)在50mL二惡烷中的溶液緩慢加入燒瓶中，加入后混合物在102℃保持4小時；反應完成后，將混合物冷卻至室溫；過濾和干燥后獲得白色固體8-甲基-2，4-二氧代-2，4-二氫-1H-苯并[d][1，3]-惡嗪-6-甲腈；

4)將3-溴-1-(3-氯吡啶-2-吡啶基)-1H-吡唑-5-羰基氯(0.64g，0.02mol)和8-甲基-2，4-二氧代-2，4-二氫-1H-苯并[d][1，3]-惡嗪-6-甲腈(2.05g，0.1mol)的混合物溶解在20mL無水吡啶中，然后用油浴緩慢加熱至115℃，并保持40分鐘；將反應混合物冷卻至室溫，然后用2M鹽酸酸化至pH 5，并通過過濾收集沉淀物， 所得沉淀物在混合乙酸乙酯和石油醚(1∶3，體積比)中重結晶，得到白色固體2-(3-溴-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-吡啶基)-8-甲基-4-氧代-4H-苯并[d][1，3]惡嗪-6-甲腈；

5)在7mL二甲基甲酰胺中加入2-(3-溴-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-吡啶基)-8-甲基-4-氧代-4H-苯并[d][1，3]惡嗪-6-甲腈(132mg，0.3mmol)、4-氨基戊酸(38.6mg，0.33mmol)和氫氧化鈉(24.6mg，0.61mmol)；混合物在室溫下攪拌12小時；將反應混合物倒入15mL水中，用2M鹽酸酸化至pH 3，然后用乙酸乙酯(5mL×3)萃??；用水(5mL×3)洗滌合并的有機層，用無水硫酸鈉干燥，過濾并濃縮；殘留物用乙酸乙酯和石油醚重結晶，得到白色固體形式的(2-(3-溴-1-(3-氯吡啶-2-吡啶基)-1H-吡唑-5-甲酰胺基)-5-氰基-3-甲基苯甲酰胺基)戊酸(溴氰蟲酰胺半抗原CNAP-4C)；

所述溴氰蟲酰胺半抗原結構式如下式所示，n為4-6的整數：

6.溴氰蟲酰胺人工抗原的制備方法，其特征在于，由權利要求5制備的所述溴氰蟲酰胺半抗原與載體蛋白偶聯后得到；所述載體蛋白選自牛血清白蛋白、卵清蛋白、鑰孔血藍蛋白、甲狀腺蛋白和人血清白蛋白中的一種或多種。