[發明專利]一種嵌合人胰島素和白介素-10雙基因重組質粒載體及其構建方法

在審

• 申請號: 202110109966.9
• 申請日: 2021-01-27
• 公開（公告）號: CN112941103A
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發明（設計）人: 趙振林
• 申請（專利權）人: 深圳市瑞普遜科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;A61K48/00;A61P3/10;A61K38/28;A61K38/20
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本發明公開了一種嵌合人胰島素和白介素?10雙基因共表達重組質粒載體及其構建方法。其步驟包括（1）設計合成Insulin?PGK?IL10目的基因。（2）設計并合成引物，擴增目的基因片段，雙酶切后回收酶切產物。（3）對質粒載體pcDNA3.1進行雙酶切，酶切位點為XhoI和NotI。（4）將目的基因片段與酶切后的pcDNA3.1連接。（5）將連接好的載體轉化感受態細菌,涂板篩選、得到Insulin和IL?10雙基因重組質粒載體。本發明所構建的載體用于胰島素依賴型糖尿病的基因治療。

技術領域

本發明涉及基因藥物研發領域，特別涉及一種嵌合胰島素和白介素-10雙基因重組質粒表達載體的構建。

背景技術

全世界大約有9％的成年人患有糖尿病，由糖尿病導致的心臟病，神經損傷，眼睛疾病和腎臟疾病等并發癥嚴重影響患者的生存質量，全世界每年約有500 萬人因為糖尿病而喪失生命，糖尿病已經成為嚴重影響人類健康的重大公共衛生問題。但目前臨床上針對糖尿病的治療沒有有效的方法，目前臨床上通過皮下注射胰島素、口服降糖藥等方法治療糖尿病，但這些治療措施只能暫時性地緩解高血糖，而不能從根本上徹底治療糖尿病以及阻止其他并發癥的發生。因此，如何讓糖尿病達到完全治愈，是人類面臨的重大挑戰。

胰島素依賴型糖尿病包括1型糖尿病和部分中晚期的2型糖尿病，其主要病理生理特點是自身免疫攻擊功能性β細胞，使胰島被破壞、數量減少、功能減退，導致胰島素分泌量不足。要想從根本上治愈胰島素依賴性糖尿病，首要問題是抑制自身免疫針對β細胞的攻擊，阻止胰島的免疫損傷，保護殘存的胰島功能；其二是促進胰島細胞再生，修復胰島功能。目前臨床上所用的藥物都不能解決這些根本問題。隨著基因工程技術的發展，基因治療為糖尿病治療開辟了新途徑。它能夠從細胞和基因水平治療糖尿病，達到臨床治愈。

基因治療是指將正常的功能基因或新基因以一定的基因轉移方式導入患者體內，表達出患者體內缺失或表達異常的蛋白質，重新賦予其正常的或新的生理功能。針對胰島素依賴型糖尿病，其基因治療的基本目標有兩個：第一是使體內恢復胰島素分泌；第二是抑制針對胰島的自身免疫損傷。如果將這兩個目的同時設計到一個方案中，才是最佳的基因治療策略。

基于上述基因治療策略，構建包含胰島素為目的基因的表達載體是實現上述糖尿病基因治療策略的主要內容，正常情況下胰島素的加工、成熟及分泌只能在胰島β 細胞中完成，但是對糖尿病患者來說胰島β 細胞被破壞，因此直接將胰島素基因轉入體內的非胰島β 細胞中，并使得胰島素能在這些細胞中加工分泌，是糖尿病基因治療的關鍵。研究發現：經過改造的胰島素原基因能在非胰島β 細胞中被表達，加工、成熟并分泌，產生具有生物活性的胰島素。

如何抑制胰島自身免疫反應也是表達載體構建的重要環節。白細胞介素-10是炎癥反應的多功能調節細胞因子，具有抑制TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-2 等Th1 類淋巴因子的合成及活性、抑制由單核細胞及巨噬細胞產生的促炎因子、抑制NK 細胞活性和T 細胞凋亡以及抑制反應性氮氧化物的產生等多種免疫調節功能。 IL-10作為一種重要的抑制性細胞因子，能夠保護胰島功能和改善外周胰島素抵抗。

構建嵌合人胰島素和白介素-10雙基因的重組質粒真核表達載體是實現糖尿病基因治療的首選方案。以這種重組載體轉染體細胞，使靶細胞表達分泌胰島素和免疫調節因子白介素-10，從而起到分泌胰島素和發揮免疫調節的作用。這一基因治療策略的特點是此基因療法創造了這些胰島素生成細胞也表達白介素-10，使這些被賦能表達胰島素的非β細胞對自身免疫攻擊具有抵抗力。