[發明專利]一種嵌合人胰島素和白介素-10雙基因重組質粒載體及其構建方法

在審

• 申請號: 202110109966.9
• 申請日: 2021-01-27
• 公開（公告）號: CN112941103A
• 公開（公告）日: 2021-06-11
• 發明（設計）人: 趙振林
• 申請（專利權）人: 深圳市瑞普遜科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;A61K48/00;A61P3/10;A61K38/28;A61K38/20
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1.一種嵌合人胰島素基因和白介素-10基因的雙基因共表達重組質粒載體，其組成部件特征為：目的基因為Insulin-PolyA-PGK-IL10，質粒載體選用pcDNA3.1，載體原件為CMV-MCS-SV40-Neo；酶切位點1為XhoI，酶切位點2為NotI；所構建重組質粒載體結構為pcDNA3.1-CMV-Insulin-PolyA-PGK-IL10-BGH,質粒大小為6822bp（見摘要附圖）。

2.根據權利要求1所述的一種嵌合人胰島素基因和白介素-10基因的雙基因共表達重組質粒載體，其合成的目的基因結構為Insulin-PolyA-PGK-IL10，大小1463bp（見 SEQ IDNO.1），

特點在于目的基因設計采用共表達模式，在胰島素基因和白介素-10基因之間插入一個PolyA和一個PGK啟動子，PolyA作為Insulin轉錄的終止信號，而且防止合成的mRNA被降解掉，對mRNA的穩定性有著非常重要的意義；PGK（phosphoglycerate kinase 1 promoter）作為白介素-10的啟動子，插入到白介素-10的前面。

3.根據權利要求1所述的一種嵌合人胰島素基因和白介素-10基因的雙基因共表達重組質粒載體，重組質粒載體采取雙啟動子方式設計：上游CMV啟動子-Insulin-PolyA終止信號-PGK啟動子-IL10-BGH終止信號。

4.根據權利要求1所述的一種嵌合人胰島素基因和白介素-10基因的雙基因共表達重組質粒載體，其構建方法特征在于包括如下步驟：（1）人工合成Insulin-PolyA-PGK-IL10目的基因（2）以所合成的Insulin-PolyA-PGK-IL10基因為模板設計引物，分別在上游引物的5’端插入一個XhoI酶切位點 ,在下游引物的5’端插入一個NotI酶切位點，合成引物，對目的基因片段進行PCR擴增，對擴增產物進行雙酶切后回收酶切產物片段（3）對質粒載體pcDNA3.1進行雙酶切.以酶切位點為XhoI和NotI（4）將酶切后的質粒載體pcDNA3.1與目的片段連接，（5）將連接好的重組質粒轉化感受態細菌 ,涂板篩選、酶切測序鑒定，得到胰島素和白介素-10雙基因共表達重組質粒載體。

5.根據權利要求1所述的一種嵌合人胰島素基因和白介素-10基因的雙基因共表達重組質粒載體，目的基因擴增，以所合成的Insulin-PolyA-PGK-IL10基因為模板設計引物，分別在上游引物的5’端插入一個XhoI酶切位點 ,在下游引物的5’端插入一個NotI酶切位點：

p1(XhoI)：

AGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTCTCGAGGCCACCATGGCCCTGTGGATGCGCC

p2(NotI)：

CGGGTTTAAACGGGCCCGGATCCAAGCGGCCGCTCAGTTTCGTATCTTCATTGTCATGTAGGCTTC。

6.根據權利要求1所述的一種嵌合人胰島素基因和白介素-10基因的雙基因共表達重組質粒載體，目的基因PCR擴增，其特征在于PCR擴增條件為：

預變性94℃，2min；變性98℃，10s；退火59℃，30s；延伸68℃，90s；終延伸68℃，5min，變性-延伸30個循環。

7.根據權利要求1所述的一種嵌合人胰島素基因和白介素-10基因的雙基因共表達重組質粒載體，其功效是通過轉染靶細胞過表達胰島素和白介素-10，分泌胰島素用于補充體內胰島素缺乏，分泌白介素-10可以抑制自身免疫對胰島細胞的攻擊，起到調節免疫保護胰島功能的作用，本發明集兩功能以一體，是基因治療胰島素依賴型糖尿病的理想重組質粒制品。