[發明專利]一種dcas9介導檢測SARS-CoV-2N基因的免疫層析方法

在審

• 申請號: 202110108827.4
• 申請日: 2021-01-27
• 公開（公告）號: CN112680550A
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發明（設計）人: 周勇;唐銀
• 申請（專利權）人: 重慶威斯騰前沿生物研究院有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12Q1/6804;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了檢測SARS?CoV?2 N基因的免疫層析方法，包括：步驟1，針對靶標基因設計特異性引物及sgRNA序列；步驟2，取待測樣本RNA，并加入5'端標有生物素的引物，進行RT?RPA核酸擴增，得到擴增產物；步驟3，在擴增產物里加入dcas9蛋白及sgRNA進行反應，形成dcas9/sgRNA/SARS?CoV?2 N?biotin復合物；步驟4，將反應產物加入免疫層析試紙條，即可判讀結果。本發明通過信號放大后，由sgRNA/dcas9復合物再次識別靶標基因，特異性高，穩定性強，靈敏度高；且當靶標基因改變時，只需要更換引物及sgRNA序列，免疫層析試紙條則可以通用，可擴展性強。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，涉及一種檢測SARS-CoV-2 N基因的免疫層析方法。

背景技術

核酸檢測屬于分子診斷，應用分子生物學方法檢測受檢個體或其攜帶的病毒、病原體的遺傳物質的結構或表達調控的變化水平，為疾病的防治、預測、診斷、治療和預后判斷提供信息和決策依據的技術。由于分子診斷技術可針對產生疾病的相關基因進行準確診斷，特異性強，靈敏度高，可應用于傳染性疾病、血液篩查、遺傳性疾病、腫瘤分子診斷等領域，還能在部分應用領域替代其他體外診斷技術，成為體外診斷技術中重要的發展和研究方向。

核酸檢測通常結合擴增技術，將微量的特異性核酸序列放大到能夠被儀器檢測到的水平。傳統的核酸檢測有聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR) 和逆轉錄-聚合酶鏈反應(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，PCR)，前者擴增DNA，后者則擴增RNA，是目前臨床應用最廣泛的分子診斷技術。PCR 技術核酸擴增分三個基本反應步驟，分別是變性、退火(復性)和延伸，每完成一次這三個步驟為一個循環，一般需要進行幾十個循環，耗時2至3個小時，且需要精準的溫度和時間控制。RPA核酸擴增技術是一種在等溫條件(37℃)下， 5-30分鐘之內就可以達到目的基因擴增放大幾百萬倍的等溫擴增技術，相比較于 PCR核酸擴增技術更快速，更易操作，有更寬闊的應用場景。

免疫層析技術是基于抗原抗體特異性免疫反應的新型膜檢測技術。該技術以固定有檢測線(包被抗體或包被抗原)和質控線(抗抗體)的條狀纖維層析材料為固定相，測試液為流動相，膠體金標記抗體或抗原固定于連接墊，通過毛細管作用使待分析物在層析條上移動。檢測快速，方便，結果肉眼可見，具有良好的臨床應用前景和意義。

CRISPR-Cas9是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。而CRISPR-Cas9基因編輯技術，則是對靶向基因進行特定DNA修飾的技術，這項技術也是目前用于基因編輯中前沿的方法。CRISPR-Cas9 是基因組調控技術中靈活性最強的系統之一。Cas9 的核酸酶剪切活性取決于兩個結構域:RuvC和HNH。這兩個結構域分別負責切割 DNA鏈的兩條鏈，并且這兩個結構域能夠單獨地被人工點突變失活。當 RuvC 和HNH 同時處于失活狀態時 ( D10A＆H840A; RuvC-＆HNH-)，Cas9 將不具有核酸酶活性，成為 dCas9(deadCas9) 。dCas9 雖然沒有剪切 DNA 的能力，但仍然可以在gRNA 的引導下與特定的 DNA 序列結合。

本發明將CRISPR/Cas系統、RPA核酸擴增技術和免疫層析技術結合，建立一種快速、特異地檢測SARS-CoV-2 N基因（靶標核酸）的免疫層析方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種檢測SARS-CoV-2 N基因的免疫層析方法，該方法采用RPA等溫擴增結合CRISPR/Cas9系統建立快速檢測靶標核酸的的免疫層析方法，特異性好，靈敏度高，可靠性好，可用于臨床現場檢測。

為達到上述目的，本發明采用以下技術方案：

一種檢測SARS-CoV-2 N基因的免疫層析方法，包括以下幾個步驟：