[發明專利]一種dcas9介導檢測SARS-CoV-2N基因的免疫層析方法

在審

• 申請號: 202110108827.4
• 申請日: 2021-01-27
• 公開（公告）號: CN112680550A
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發明（設計）人: 周勇;唐銀
• 申請（專利權）人: 重慶威斯騰前沿生物研究院有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12Q1/6804;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種檢測SARS-CoV-2 N基因的免疫層析方法，其特征在于：包括以下幾個步驟：

步驟（1），針對SARS-CoV-2 N基因設計特異性引物及sgRNA序列；所述特異性引物的5'端標記生物素，所述sgRNA的識別序列位于擴增產物內部；

步驟（2），利用RPA等溫核酸擴增技術，取待測樣本RNA，并加入步驟（1）中5' 端標有生物素的特異性引物，進行RT-RPA核酸擴增，得到擴增產物；

步驟（3），結合CRISPR/Cas9系統，在擴增產物里加入dcas9蛋白及步驟（1）中的sgRNA序列進行反應，形成dcas9/sgRNA/SARS-CoV-2 N-biotin蛋白核酸復合物；

步驟（4），將步驟（3）中的反應產物加入免疫層析試紙條，即可判讀結果：若試紙條T線和C線均有紅色條帶，表明是陽性樣品；若試紙條C線有帶，T線無帶，表明是陰性樣品；若試紙條C線無帶，則檢測無效，需要重復檢測。

2.如權利要求1所述的一種檢測SARS-CoV-2 N基因的免疫層析方法，其特征在于：所述特異性引物F序列為：5’-CAGTCAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACG-3’，如SEQ ID NO:1所示；所述特異性引物R序列為：5’-CATTGCCAGCCATTCTAGCAGGAGAAGTTC-3’，如SEQ ID NO:2所示。

3.如權利要求1所述的一種檢測SARS-CoV-2 N基因的免疫層析方法，其特征在于：所述sgRNA序列為：

AGUUCAAGAAAUUCAACUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU，如SEQ ID NO:3所示。

4.如權利要求1所述的一種檢測SARS-CoV-2 N基因的免疫層析方法，其特征在于：所述步驟（2）中，RT-RPA核酸擴增體系為：10 uM引物F 2.4 ul，10 uM引物R 2.4 ul，RPA-reacting Buffer 29.5 ul，待測樣本5 ul，280 nM MgOAC 2.5 ul，100,000U/mLProtoScript RT 1 ul，RNase Free Water 7.2 ul。

5. 如權利要求1所述的一種檢測SARS-CoV-2 N基因的免疫層析方法，其特征在于：所述所述步驟（3）中，CRISPR體系為：等溫擴增產物 50 ul，100 ng/u dcas9 4-8 ul，100 ng/ul sgRNA 4-8 ul，10X-Reacting Buffer 10 ul，20 U/μL SUPERase?In? RNaseInhibitor 5 ul，RNase Free Water To 100 ul。

6.一種如權利要求1所述的一種檢測SARS-CoV-2 N基因的免疫層析方法，其特征在于：所述步驟（4）中，免疫層析試紙條包括依次相連接的吸水墊、基膜、金標墊和樣品墊；所述基膜上設置有C線和T線，所述C線上包被有抗抗體，所述T線上包被有鏈酶親和素；所述金標墊中含有膠體金標記的dcas9抗體。