[發(fā)明專利]從頭合成萊鮑迪苷M的釀酒酵母工程菌及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110106054.6
• 申請日: 2021-01-26
• 公開（公告）號: CN112852653A
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉龍;陳堅;呂雪芹;堵國成;李江華;徐雅夢;房峻
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N9/02;C12N9/10;C12N9/88;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/60;C12P19/56;C12R1/865
• 代理公司: 蘇州市中南偉業(yè)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32257
• 代理人: 王玉仙

本發(fā)明公開了一種從頭合成萊鮑迪苷M的釀酒酵母工程菌及其應(yīng)用，屬于代謝工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的釀酒酵母工程菌整合表達(dá)了貝殼杉烯合酶fpps、貝殼杉烯合酶ks、貝殼杉烯酸氧化酶ko、甜菊醇合酶kah、UDP葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶ugt74g1、UDP葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶ugt85C2、UDP葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶eugt11和UDP葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1。本發(fā)明提供的重組釀酒酵母可實現(xiàn)以葡萄糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)萊鮑迪苷M，并在胞內(nèi)積累，為代謝工程改造釀酒酵母從頭合成萊鮑迪苷M奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明提供的重組釀酒酵母的構(gòu)建方法簡單，便于使用，具有很好地應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種從頭合成萊鮑迪苷M的釀酒酵母工程菌及其應(yīng)用，屬于代謝工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

萊鮑迪苷(Rebaudioside M，Reb M)，屬于甜菊糖中的一種口感好且無后苦味的一種甜味成分。甜菊糖，又名甜菊糖苷，具有高甜度(蔗糖的300～450倍)、低熱值(蔗糖的1/300)等特點，天然蔗糖替代品，被譽為“世界第三糖原”。甜菊糖是從甜葉菊中萃取甜菊糖苷凈化而來的產(chǎn)物。生產(chǎn)商們在甜葉菊中提取出的甜菊糖苷大都是Reb A類型。這種類型的甜菊糖苷因為含量高所以最容易提取，但卻是苦味的來源。研究發(fā)現(xiàn)新的甜菊糖苷——Reb D和Reb M。這兩種甜菊糖苷不帶苦味，但是在甜葉菊中含量極低——在甜葉菊的干葉中，RebA就占了1/3，而Reb D和Reb M占不到1％。為了解決這個問題，需要培育富含Reb D和Reb M的新甜葉菊品種，但其所需要的先進(jìn)技術(shù)和設(shè)備都仰賴大量資金。即便在甜菊糖的最大出口國中國，大多數(shù)生產(chǎn)商也無法負(fù)擔(dān)得起。目前采用基因工程法構(gòu)建基因工程菌株從頭合成天然產(chǎn)物其具有低成本、原料不受限制、提取過程簡單、無季節(jié)性、生產(chǎn)時間短，對環(huán)境污染小等諸多優(yōu)點，從而受到廣大學(xué)者的青睞。

微生物發(fā)酵法具有可持續(xù)性、綠色環(huán)保的社會經(jīng)濟(jì)效益，采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)萊鮑迪苷M是解決上述問題的有效途徑。由于微生物中不具有Reb M合成途徑，因此本研究以Reb M為最終目標(biāo)產(chǎn)品進(jìn)行代謝改造。目前，未有關(guān)于微生物發(fā)酵法以葡萄糖為底物從頭合成萊鮑迪苷M的相關(guān)報道。

釀酒酵母是又稱面包酵母或者出芽酵母。釀酒酵母是與人類關(guān)系最廣泛的一種酵母，作為食品安全菌株已用于制作面包和饅頭等食品、釀酒工業(yè)。近年來，學(xué)者們開始研究利用釀酒酵母生產(chǎn)天然產(chǎn)物，如青蒿酸、三七皂苷等。相比大腸桿菌而言，釀酒酵母具有高安全性，低致病性，高抗逆性，而且受噬菌體污染的概率較低等優(yōu)點，因此它也在基因工程領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。然而，釀酒酵母中沒有Reb M合成的代謝通路。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用CRISPR Cas9技術(shù)將Reb M的代謝途徑整合至釀酒酵母，由于Reb M合成的前體焦磷酸異戊二烯和二甲基丙烯基二磷酸積累對細(xì)胞生長有毒，因此我們選用葡萄糖抑制型啟動子P_gal1/10，將使細(xì)胞生長和萊鮑迪苷M的生產(chǎn)分離，以達(dá)到高效合成萊鮑迪苷M的效果。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種從頭合成萊鮑迪苷M的釀酒酵母工程菌，所述的釀酒酵母工程菌整合表達(dá)了貝殼杉烯合酶fpps、貝殼杉烯合酶ks、貝殼杉烯酸氧化酶ko、甜菊醇合酶kah、UDP葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶ugt74g1、UDP葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶ugt85C2、UDP葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶eugt11和UDP葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶ugt76g1。

進(jìn)一步地，所述的釀酒酵母工程菌是以啟動子P_gal1/10控制基因表達(dá)。

進(jìn)一步地，所述的啟動子P_gal1/10是由β-半乳糖和葡萄糖共同誘導(dǎo)的啟動子Gal1和Gal10組成的雙向啟動子。

進(jìn)一步地，所述的啟動子P_gal1/10的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。