[發明專利]一種蘆丁對呲柔比星誘導的心肌細胞損傷的保護作用研究方法

在審

• 申請號: 202110104345.1
• 申請日: 2021-01-26
• 公開（公告）號: CN113151392A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發明（設計）人: 任立群;李琪;李相軍;王亞帝;張袆冰
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12Q1/66;C12Q1/6851;G01N21/64
• 代理公司: 合肥順超知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 34120
• 代理人: 徐文恭;張芳

1.一種蘆丁對吡柔比星誘導的心肌細胞損傷的保護作用研究方法，其特征在于，具體分為以下步驟：

S1、將小鼠HL-1心肌細胞系、人乳腺上皮細胞MCF 10A和人乳腺癌細胞系MDA-MB-231在高糖培養基(DMEM；10％胎牛血清(FBS；Hyclone)中培養；

S2、在DMSO中制備1mol/L的RUT儲備溶液，并在-20℃下保存，用無血清培養基稀釋溶液，并將DMSO的濃度控制在0.1％以下，將細胞以5×10⁴細胞/mL的密度接種在96孔板中24小時，然后用不同濃度的RUT(0–800μM)處理，與RUT孵育6小時，12小時和24小時后，向每個孔中添加10μL細胞計數試劑盒8，在37℃下溫育2小時后，使用BioRad POLARstar酶標儀測量450nm處的吸光度；

S3、用無血清DMEM稀釋THP溶液；

S4、miR-129-1-3p mimics,mimics陰性對照(mimics NC)，miR-129-1-3p模擬物在5'端用FAM綠色熒光料標記，mmu-miR-129-1-3p mimics,Forward:AAGCCCUUACCCCAAAAAGUAU，Reverse:ACUUUUUGGGGUAAGGGCUUUU；

mimicsNC,Forward:UUCUCCGAACGUGUCACGUTT,Reverse:ACGUGACACGUUCGGAGAATT，使用Lipofectamine2000在無血清培養基中轉染細胞8小時，轉染完成后，將無血清培養基替換為新鮮正常培養基，轉染效能以陽性核數與總核數之比計算；

S5、使用DCFH-DA ROS測定試劑盒測定細胞內ROS水平；

S6、S5步驟處理后，將細胞固定在4％多聚甲醛中，并在0.1％Triton-X 100中透化，使用TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒評估細胞凋亡，用DAPI對細胞進行復染，并在BX43熒光顯微鏡下以100倍放大率進行分析，以TUNEL陽性細胞核與總細胞核的比率計算凋亡率；

S7、使用公共領域數據庫進行GO分析和KEGG通路富集分析，通路調控網絡使用Cytoscape軟件映射可視化，使用TargetScan數據庫篩選鑒定了miR-129-1-3p的潛在靶標；

S8、使用來自HL-1細胞的基因組DNA PCR擴增了含有miR-129-1-3p假定結合位點的GRIN2D的野生型3′-非翻譯區(UTR)，相應的3'-UTR突變體是通過改變miR-129-1-3p結合位點的種子區域而產生的，將野生型和突變型3′-UTRs亞克隆到螢光素酶基因下游的psiCHECK-2螢光素酶載體中，兩種構建體均通過DNA測序驗證，HL-1細胞與miR-129-1-3p模擬物或miR-129-1-3p抑制劑以及包含野生型或突變型3′-UTR的熒光素酶質粒在24孔板中共轉染，轉染后48小時，使用雙重熒光素酶報告基因測定系統確定熒光素酶活性，并標準化至海腎活性；

S9、使用熒光Ca²⁺敏感染料Fluo-3 AM測量細胞內鈣水平，在用PBS洗滌之后，在37℃下向細胞加入5μM Fluo-3AM 30分鐘，并在BX43熒光顯微鏡下以100倍放大率進行檢查，細胞內Ca²⁺積累評估為Fluo-3 AM陽性核與總核的比率；

S10、待MDA-MB-231細胞單層融合度接近孔底的100％時，用200μl的黃槍頭垂直在細胞上劃線，將漂浮的細胞用PBS洗去，繼續培養；

S11、使用TransZol提取總RNA；

S12、統計方法采用SPSS23.0統計軟件處理數據，數據符合正態分布并經方差齊性檢驗，數據以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間兩兩之間比較采用SNK-q檢驗，P0.05為差異有統計學意義。

2.根據權利要求1所述的一種RUT對THP誘導的心肌細胞損傷的保護作用研究方法，其特征在于：所述步驟S1中的細胞培養環境為37℃、含5％CO₂的潮濕環境。