[發明專利]一種敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T細胞的制備方法和應用

在審

• 申請號: 202110101793.6
• 申請日: 2021-01-26
• 公開（公告）號: CN113005092A
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 廖興華;王君;張慧敏;項園;李佳蓬;李慧;張同存
• 申請（專利權）人: 武漢科技大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N5/0783;C12N15/85;C12N15/62
• 代理公司: 武漢紅觀專利代理事務所(普通合伙) 42247
• 代理人: 李杰梅

一種敲除PD1的靶向LMP1的CAR?T細胞的制備方法，包括如下步驟：S1，構建PD1基因sgRNA質粒pGL3?U6?hPD1?sgRNA和LMP1?CAR細胞質粒LMP1?CAR PiggyBac Transposon，將pGL3?U6?hPD1?sgRNA和LMP1?CAR PiggyBac Transposon質粒與電轉緩沖液混合，制得電轉混合液，并用電轉混合液轉染PBMC細胞，得到轉染后的PBMC細胞；S2，將轉染后的PBMC細胞轉入T細胞培養基，用磁珠激活CD3陽性T細胞，并培養擴增轉染后的PBMC細胞，獲得敲除PD1的LMP1?CAR?T細胞。本發明采用靶向LMP1的CAR?T細胞聯合敲除PD1的聯合治療，對患者的T細胞進行PD1敲除，糾正免疫逃逸，恢復患者的免疫功能，增強CAR?T細胞攻擊淋巴瘤的效應。在制備EVB淋巴瘤診斷試劑或治療藥物中的應用具有重要的臨床意義。

技術領域

本發明涉及醫學生物領域，尤其涉及一種敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T細胞的制備方法和應用。

背景技術

EBV病毒是重要的致瘤病毒，引發一系列淋巴細胞惡性克隆，難醫治且容易復發。CAR-T(嵌合抗原受體T細胞)治療是目前治療難治復發血液系統腫瘤的重要方法，針對B細胞急性白血病，淋巴瘤，獲得了非常好的療效數據。但是存在一些問題，比如因缺乏腫瘤特異性的靶抗原導致的脫靶效應以及嚴重的CRS(細胞因子釋放綜合征)，因此靶點的選擇是CAR-T細胞治療重要的研究內容。

淋巴瘤末期患者的腫瘤免疫逃逸，主要表現為患者T細胞PD1分子的上調和淋巴瘤PDL1的上調，導致約30％的患者無法獲得足夠的數量和功能的自體T細胞，無法進行CAR-T細胞治療。絕大多數的EBV淋巴瘤存在的PD1和PDL1的上調都是因為LMP1的調控導致的，因此敲除T細胞PD1糾正腫瘤免疫逃逸，是淋巴瘤末期患者進行CAR-T細胞治療的關鍵。

發明內容

有鑒于此，本發明提出了可特異性敲除PD1，且不會產生嚴重的CRS的一種敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T細胞的制備方法和應用。

本發明的技術方案是這樣實現的：本發明提供了一種敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T細胞的制備方法和應用。

一種敲除PD1的靶向LMP1的CAR-T細胞的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1，構建PD1基因sgRNA質粒pGL3-U6-hPD1-sgRNA和LMP1-CAR細胞質粒LMP1-CARPiggyBac Transposon，將pGL3-U6-hPD1-sgRNA和LMP1-CAR PiggyBac Transposon質粒與電轉緩沖液混合，制得電轉混合液，并用電轉混合液轉染PBMC細胞，得到轉染后的PBMC細胞；

S2，將轉染后的PBMC細胞轉入T細胞培養基，用磁珠激活CD3陽性T細胞，并培養擴增轉染后的PBMC細胞，獲得敲除PD1的LMP1-CAR-T細胞。

在以上技術方案的基礎上，優選的，所述pGL3-U6-hPD1-sgRNA質粒的PD1基因序列選自5'-GGN(19)GG、5'-GN(20)GG和5'-N(21)GG中的一種。

在以上技術方案的基礎上，優選的，所述pGL3-U6-hPD1-sgRNA質粒的構建方法為：

S1，在PD1基因的sgRNA核苷酸鏈序列的5’加上CCGG，合成正向寡核苷酸，對應互補鏈序列的5’加上CACG，合成反向寡核苷酸；

S2，將合成的1對互補的sgRNA寡聚核苷酸成對變性、退火后，形成可連入U6真核表達載體的雙鏈sgRNA寡聚核苷酸；

S3，將退火的sgRNA寡聚核苷酸雙鏈與線性化pGL3-U6-sgRNA質粒連接獲得pGL3-U6-hPD1-sgRNA質粒。